食源性微生物通过调控菌群动态促进抗生素扰动后肠道内接合性质粒介导的耐药基因传播

　　本研究发现，源自新鲜胡萝卜的食源性微生物虽抑制了沙门氏菌定植，却在经链霉素预处理的扰动肠道微生态中，显著促进了多重耐药接合性质粒pIncA/C向肠杆菌科细菌（如大肠杆菌、肠杆菌属等）的水平转移。该研究揭示了食物基质微生物通过影响宿主种群动态，间接加速抗生素耐药基因（ARGs）在肠道环境中的传播，为防控食源性抗生素耐药性（AMR）扩散提供了关键实验依据。

　　

Abstract

食源性微生物对预扰动肠道微生物组中抗生素耐药性质粒接合转移的影响是当前抗生素耐药性（AMR）研究的重要课题。研究表明，摄入抗生素耐药细菌可能导致抗菌素耐药基因（ARGs）在受干扰的肠道菌群中传播，但食物基质中的微生物如何影响这一过程尚不明确。本研究利用已建立的小鼠模型，评估源自新鲜胡萝卜的食源性微生物对多重耐药质粒pIncA/C从海德堡沙门氏菌（供体）向鼠伤寒沙门氏菌（受体）接合转移的影响。与先前无食源性微生物时供体和受体细菌高密度定植的结果相反，食源性微生物的存在导致鼠伤寒沙门氏菌丰度较低，且在所有小鼠粪便样本中均未检测到鼠伤寒沙门氏菌接合子。然而，在经链霉素预处理的小鼠中，微生物物种丰富度的显著降低使得肠杆菌科细菌显著富集，pIncA/C质粒成功转移至埃希氏菌属、肠杆菌属、柠檬酸杆菌属和变形杆菌属的细菌中。这些发现表明，食源性微生物可能通过影响预扰动肠道微生物组中细菌宿主的种群动态来增强ARGs的传播。

Introduction

抗菌素耐药性（AMR）对公共卫生构成重大威胁，挑战了抗菌药物的有效性，并削弱了我们对抗传染病的能力。农业中抗菌药物的过度使用导致抗微生物耐药细菌（ARB）和AMR基因（ARGs）在农业系统和环境中广泛传播。这些ARB和ARGs可能通过污染的内类、乳制品、作物和蔬菜进入食物链并传播给人类。摄入后，机会性AMR病原体可能定植于肠道，导致食源性疾病，其特征是胃肠道症状、全身感染，严重时甚至危及生命。此外，ARB通过食物的传播有助于ARGs在人类肠道微生物群中的传播，从而延续AMR的循环，并使传染病的治疗选择复杂化。

水平基因转移（HGT）是ARGs在细菌种群中传播的关键因素。接合作用是细菌HGT的主要机制，通过两个细菌细胞之间的直接细胞接触促进遗传物质（如质粒、转座子和基因组岛）的转移。微生物种群动态，包括种群密度、物种多样性和代谢活性，可显著影响微生物群落内接合的频率和结果。高细菌种群密度可通过增加供体和受体细胞相遇的可能性来促进接合。不同细菌物种的存在为基因转移提供了广泛的潜在供体和受体。细菌种群的代谢活性和生长阶段会影响它们对接合的敏感性。处于指数生长期的细菌可能表现出比稳定期细胞更高的接合率，因为活跃分裂的细胞更可能表达DNA转移和重组所需的细胞机制。此外，环境因素，如pH、温度、氧气可用性、营养浓度和抗生素暴露，可塑造微生物群落结构和动态，影响接合潜在供体和受体的可用性。

人类肠道微生物群是一个共生的微生物群落，由栖息在胃肠道中的数万亿微生物组成。健康的肠道微生物群的特点是物种多样性高，包括来自不同门的大量细菌分类群，包括厚壁菌门、拟杆菌门、放线菌门、变形菌门和疣微菌门。肠道微生物群携带多种多样的ARGs，称为肠道耐药组。各种因素，如宿主遗传、生活方式、饮食、环境暴露和药物使用，可塑造肠道微生物群的组成并影响肠道耐药组的动态。因此，肠道环境为ARGs的接合转移提供了一个独特的生态位。

健康的肠道微生物群是抵御外源微生物定植的关键屏障，通过生态位竞争、抗菌物质产生、增强黏膜屏障功能和调节宿主免疫反应等机制提供定植抗性。然而，抗生素有可能破坏肠道微生物群的平衡，降低微生物多样性，并为机会性抗菌耐药病原体的过度生长提供生物学机会。即使是短程抗生素治疗也能使食源性大肠杆菌中的AMR质粒接合转移至肠道沙门氏菌以及常住大肠杆菌和肺炎克雷伯菌。此外，先前接触抗生素可引起肠道微生物群的扰动，降低对ARB的定植抗性，并增加ARGs接合转移的潜力。

基于先前的研究结果，本研究旨在进一步探索背景食源性微生物是否以及如何影响抗生素预扰动肠道微生物组中AMR质粒的接合转移。我们利用小鼠模型，给予氨苄青霉素、磺胺二甲嘧啶、链霉素或不给予抗生素作为阴性对照。随后，我们通过口服接种小鼠，以海德堡沙门氏菌作为多重耐药接合质粒IncA/C（pIncA/C）的供体，以β-内酰胺敏感的鼠伤寒沙门氏菌菌株作为受体，以及源自田间新鲜采收胡萝卜的食源性微生物。我们分析了食源性微生物和耐药组组成以及小鼠肠道微生物组成。我们还评估了供体、受体、接合子和代表性ARGs的动态，这些基因包括pIncA/C上编码的bla_CMY、aph(3″)-Ib和sul1，以及肠道共生菌中高度流行的cfxA、ermF和tetQ。

Materials and methods

Bacteria

肠道沙门氏菌海德堡血清型（SL-312）分离自加拿大养鸡场，携带一个接合性多重耐药IncA/C质粒。IncA/C质粒（pIncA/C）编码aph(3′)-Ia、aph(3″)-Ib、aph(6)-Id、bla_TEM、bla_CMY、dfrA1、floR、sul1、sul2和tetA基因。海德堡沙门氏菌（pIncA/C）对阿莫西林/克拉维酸、氨苄青霉素、头孢唑林、头孢西丁、头孢泊肟、头孢噻呋、头霉素、氯霉素、链霉素、磺胺甲噻二唑、四环素和甲氧苄啶-磺胺甲恶唑耐药。在本研究中，海德堡沙门氏菌（pIncA/C）被用作供体。肠道沙门氏菌鼠伤寒血清型（SL1344）的利福平耐药突变体被用作受体，其携带一个移动IncQ质粒，编码aph(3″)-Ib、aph(6)-Id和sul2基因。

Food-borne microbes

本研究中使用的食源性微生物源自田间生长的胡萝卜（Daucus carota var. Ibiza hybrid）。简要来说，胡萝卜种植并采收自加拿大安大略省伦敦附近的环境科学西部野外站。采收后，去除多余土壤，用无菌超纯水清洗两次并手动去皮。将50克胡萝卜皮部分在单独的Filtra-Bag匀浆袋中与100毫升无菌偏磷酸盐溶液一起用匀浆机捣碎30秒。从胡萝卜皮匀浆中收集的含微生物滤液随后在-80°C下储存备用。

胡萝卜皮匀浆解冻后，在4°C或冰上无菌条件下进一步处理。将5毫升胡萝卜皮匀浆通过100 μm尼龙网使用Falcon细胞过滤器离心过滤，离心力为5000 × g，持续5分钟。用5毫升无菌缓冲蛋白胨水（BPW）洗涤细胞过滤器上的碎片，并在5000 × g下离心5分钟。收集滤液并在10,000 × g下离心30分钟以沉淀细菌细胞。去除上清液后，将细菌细胞重新悬浮于2毫升BPW中，并指定为食源性微生物。将食源性微生物连续10倍稀释并涂布在营养琼脂、Chromocult琼脂和补充有50 μg·mL^?1氨苄青霉素的Chromocult琼脂（Chr-Amp）上。所有琼脂平板在37°C下培养过夜，然后对需氧细菌、肠杆菌科、大肠杆菌以及耐氨苄青霉素的肠杆菌科和大肠杆菌进行计数。食源性微生物还进行了沙门氏菌属的分离程序。

In vitro conjugation

海德堡沙门氏菌（供体）和鼠伤寒沙门氏菌（受体）之间的体外接合按照所述方法进行评估。使用补充有50 μg·mL^?1氨苄青霉素（XLT4-Amp）；50 μg·mL^?1利福平（XLT4-Rif）；以及50 μg·mL^?1氨苄青霉素和50 μg·mL^?1利福平（XLT4-Amp-Rif）的XLT4琼脂分别对供体、受体和接合子细菌进行计数。此外，还测试了使用食源性微生物作为供体和鼠伤寒沙门氏菌作为受体的β-内酰胺耐药性接合转移潜力。接合频率表示为接合结束时计数的接合子与受体的比率。

In vivo conjugation

小鼠实验和程序符合加拿大动物护理委员会和体内实验报告（ARRIVE）指南的准则和伦理标准，并获得加拿大食品检验局渥太华实验室-法罗菲尔德动物护理委员会的批准。从Charles River Laboratories购买28日龄雌性C57BL/6小鼠。小鼠混合并适应2周后接受抗生素治疗。然后将它们每笼饲养2或3只小鼠，自由饮水和摄食。总共21只小鼠随机分为四组进行抗生素预处理：无抗生素、氨苄青霉素、链霉素和磺胺二甲嘧啶。抗生素停药24小时后，分别以1小时间隔给小鼠接种受体、供体和食源性微生物。每个接种物（50 μL）调整至OD₆₀₀读数为1.0，通过口服灌胃给药。实验程序时间表如图所示。在每个采样日，对小鼠称重并观察临床症状，如竖毛、弓背和嗜睡。在感染后（DPI）-7（基线）、1、3、7、10、14、17和21天收集所有小鼠的粪便颗粒。按照所述方法处理粪便颗粒，用于DNA提取和细菌计数。使用三种选择性琼脂：补充有50 μg·mL^?1氨苄青霉素和50 μg·mL^?1四环素（XLT4-Amp-Tet）的XLT4琼脂；50 μg·mL^?1利福平和50 μg·mL^?1链霉素（XLT4-Rif-Strep）；以及50 μg·mL^?1氨苄青霉素、50 μg·mL^?1利福平和50 μg·mL^?1链霉素（XLT4-Amp-Rif-Strep）的XLT4琼脂，分别用于计数供体、受体和推定的鼠伤寒沙门氏菌接合子。此外，使用补充有50 μg·mL^?1氨苄青霉素（Chr-Amp）的Chromocult琼脂分离潜在的肠杆菌科接合子。细菌计数的限值为2.2 log₁₀菌落形成单位（CFU）·g^?1粪便。

Whole-genome sequencing

为鉴定推定的接合子细菌，从每只小鼠的XLT4-Amp-Rif-Strep和Chr-Amp培养基上分离具有不同形态特征的各种细菌类型中的三个菌落。这些分离株在LB琼脂上亚培养以产生单分离菌落用于全基因组测序。总共对151个分离株进行了测序。将单菌落在脑心浸液肉汤中于37°C培养过夜。然后使用Maxwell? RSC仪器从300 μL这些培养物中提取基因组DNA。使用Qubit? dsDNA HS检测试剂盒和Qubit? 3.0荧光计测量双链基因组DNA的量。使用Nextera XT DNA样品制备试剂盒和Nextera XT索引试剂盒制备测序文库。在Illumina MiSeq平台上使用600循环MiSeq试剂盒（v3）进行配对末端测序，并包括6% Phi-X对照。使用COWBAT v0.5.0.23进行基因组组装和分析，这是一个综合工具，集成了几个步骤，如使用BBMap v38.96进行质量控制（QC）修剪，使用SKESA v2.1进行组装，使用QUAST v5.1.0进行质量评估，以及使用MOB-suite v 3.0.3进行质粒鉴定。使用MinHash（Mash）算法比较基因组组装与NCBI refseq数据库（版本70），根据所述方法鉴定细菌物种。

16S rRNA gene amplicon sequencing

使用NucleoSpin土壤DNA提取试剂盒从小鼠单个粪便颗粒和食源性微生物（250 μL）中提取的DNA进行了16S rRNA基因扩增子测序。简要来说，使用正向引物5′- TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCCTACGGGNGGCWGCAG-3′和反向引物5′-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGACTACHVGGGTATCTAATCC-3′通过PCR扩增16S核糖体RNA基因的V3–V4区域。使用Nextera XT索引试剂盒v2（Illumina）对单个扩增子文库进行双索引，然后使用NGS Normalization 96孔试剂盒进行纯化和标准化。

在Illumina MiSeq系统上使用MiSeq v3试剂盒进行测序，加载浓度为8 pmol/L，并加入10% PhiX spike-in，目标输出为每个样品100,000个原始读数。使用Fastp v 0.23.2对原始读数进行QC过滤，并使用pTrimmer v 1.3.4去除引物序列。然后使用Emu v 3.4.5和预构建的Emu数据库v 3.4.5对处理的读数进行分类，以进行准确的微生物鉴定。对不同抗生素预处理组中每个DPI的小鼠肠道微生物群的Bray–Curtis相异性进行主坐标分析。使用Chao1指数在物种水平测量物种丰富度，直接使用读数计数而不进行标准化。使用以下R包进行数据分析和可视化：vegan v 2.6-2、ggplot2 v 3.3.6、phyloseq v 1.38.0和microbiomeMarker v 1.02。

Target-enrichment resistome sequencing

采用靶向捕获宏基因组测序方法来表征从胡萝卜中回收的食源性微生物群落的耐药组组成。简要来说，使用Genomic DNA Clean & Concentrator-10试剂盒纯化从食源性微生物中提取的1 μg总DNA。使用E220 evolution聚焦超声仪在microTUBE-15中将DNA剪切至平均大小400 bp后，使用NxSeq? AmpFREE Low DNA文库试剂盒和IDT-Illumina TruSeq UD索引将其转换为独特的双索引测序文库。对于从构建的文库中基于杂交捕获和富集ARG靶标，采用先前描述的myBaits? Custom DNA-Seq试剂盒，按照试剂盒手册进行操作，随后在Illumina NextSeq 500系统上对靶标富集的DNA文库进行高通量测序，产生约3400万条2 × 150 bp配对末端序列。使用定制的生物信息学流程检测获得的测序数据集中的ARG序列靶标，设置默认参数和≥90%靶标覆盖截止值。对于ARG注释，最初从AMRFinderPlus提取抗生素类别，并从CARD数据库版本3.0.3中提取ARG机制。

Quantification of antimicrobial resistance genes

使用定量聚合酶链反应（qPCR）测定aph(3″)-Ib、sul1、bla_CMY、cfxA、emrF、tetQ和小亚基核糖体RNA片段1基因（rrnS1）的丰度。总体积为25 μL的反应混合物包含12.5 μL Power SYBR Green PCR预混液、1.25 μL正向和反向引物（引物序列和最终浓度详见表S1）、5 μL模板DNA（标准化至0.4 ng·μL^?1）和5 μL无核酸酶水。PCR程序包括在95°C下初始孵育10分钟，随后进行40个循环的95°C变性15秒，退火和延伸设定在特定温度和时间。每个DNA样品进行三次重复反应。各种基因靶标的检测限为4.3 ± 0.6 log₁₀拷贝每克粪便。

Statistical analyses

使用Welch's ANOVA followed by Dunnett's test分析抗生素预处理组与无抗生素对照组在同一天采样时每个目标细菌的平均丰度、每个靶向基因的倍数变化以及16S rRNA基因群落谱中每个分类群的相对丰度之间的差异。所有相关性均使用Pearson相关性检验进行测试。使用PERMANOVA分析抗生素预处理组之间小鼠肠道微生物群相异性的差异。处理组包含4-6只小鼠，每只小鼠在每个采样日的粪便颗粒技术重复的平均值构成一个数据点。p值 < 0.05被认为具有统计学显著性。

Results

Characterization of food-borne microbes

基于16S rRNA扩增子测序分析，食源性微生物由三个优势门组成：变形菌门、蓝藻门和厚壁菌门，相对丰度分别为0.821、0.097和0.050。根据靶向耐药组测序分析，这些微生物携带33个ARGs，其中21个ARGs属于β-内酰胺类，12个ARGs属于其他八个类别。与这些发现一致的是，通过qPCR在食源性微生物中检测到低拷贝数的bla_CMY（3.8 log₁₀拷贝·mL^?1），但未检测到cfxA、ermF、tetQ、aph(3″)-Ib或sul1基因，表明不存在pIncA/C。支持测序分析的是，细菌培养显示，从食源性微生物中回收的大多数需氧细菌（7.9 log₁₀ CFU·mL^?1）是肠杆菌科（7.1 log₁₀ CFU·mL^?1），其中包括6.4 log₁₀ CFU·mL^?1大肠杆菌，但没有沙门氏菌属。在这些细菌中，4.9 log₁₀ CFU·mL^?1肠杆菌科和4.5 log₁₀ CFU·mL^?1大肠杆菌对氨苄青霉素耐药。然而，当使用食源性微生物作为潜在供体和鼠伤寒沙门氏菌作为受体进行体外接合时，未检测到β-内酰胺耐药性的转移。相比之下，体外pIncA/C从海德堡沙门氏菌向鼠伤寒沙门氏菌的转移以每受体4.9（±3.7）× 10^–6的频率检测到。

Food-borne microbes affect Salmonella colonization and conjugation

与未接种食源性微生物的小鼠粪便中7.4 log₁₀ CFU·g^?1沙门氏菌相比，在当前研究中，所有小鼠在21 DPI内鼠伤寒沙门氏菌和海德堡沙门氏菌的排出量分别保持在3.6和5.9 log₁₀ CFU·g^?1以下，表明食源性微生物限制了沙门氏菌的粪便排出。总的来说，鼠伤寒沙门氏菌的丰度较低，并且在任何预处理的小鼠中没有显著差异。相比之下，海德堡沙门氏菌的丰度因抗生素预处理而异，链霉素预处理组的丰度最高，其次是磺胺二甲嘧啶和氨苄青霉素预处理组，无抗生素预处理组的丰度最低。在1 DPI时，链霉素和磺胺二甲嘧啶预处理组的