胞外DNA增强铜绿假单胞菌生物膜对次氯酸钠胁迫的抗性机制研究

　　本研究揭示了胞外DNA（eDNA）在铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）生物膜抵抗次氯酸钠（NaOCl）氧化胁迫中的关键作用，尤其当外多糖Psl和Pel缺失时，eDNA通过增强基质稳定性与细胞保护显著提升生物膜耐受性。成果为针对耐药生物膜的靶向干预（如DNase应用）提供了新思路，对临床感染控制和环境消杀策略具有重要启示。

　　

引言

生物膜是自然界中细菌最常见的生存形式，其由细菌细胞聚集并包裹在自身产生的细胞外聚合物（EPS）基质中构成。铜绿假单胞菌作为一种机会性人类病原体，凭借其强大的生物膜形成能力，表现出高致病性和抗菌药物耐药性。除多糖组分Psl和Pel外，胞外DNA（eDNA）是铜绿假单胞菌PAO1生物膜基质中的重要组成部分。尽管eDNA在生物膜起始、完整性维持及抗生素耐药性中的作用已被广泛研究，但其在抵抗氧化胁迫（如广泛使用的消毒剂次氯酸钠）中的功能尚不明确。

材料与方法

本研究使用铜绿假单胞菌PAO1野生型（WT）、缺失Psl和Pel外多糖的双突变株（ΔpslA pelF）以及eDNA含量增加的Tn-bfmR突变株。通过最小杀菌浓度生物膜（MBC-B）测定、荧光显微镜技术（如TOTO-1/Syto60和CTC染色）、菌落形成单位（CFU）计数及结晶紫染色生物量定量等多种方法，系统评估了eDNA在NaOCl抗性中的作用。实验还包括外源添加鲑鱼精子DNA（4 mg/mL）和DNase I处理，以模拟eDNA富集与降解条件。

结果

eDNA在NaOCl胁迫下的释放

通过TOTO-1（绿色，标记eDNA）和Syto60（红色，标记细胞）染色发现，NaOCl处理显著增加了PAO1 WT和ΔpslA pelF生物膜中eDNA的释放，且突变株的eDNA基础水平及应激释放量均高于野生型。这表明NaOCl诱导的细胞裂解可能是eDNA释放的主要来源，而外多糖缺失加剧了消毒剂渗透与eDNA溢出。

eDNA增强生物膜NaOCl抗性

外源添加DNA使PAO1 WT和ΔpslA pelF的MBC-B值分别从15 μg/mL升至38 μg/mL和从6 μg/mL升至16 μg/mL，耐药性提升超2倍。结晶紫染色证实eDNA补充增加了两株菌的生物膜生物量。CTC染色显示，添加eDNA后，经8 μg/mL和16 μg/mL NaOCl处理的生物膜中代谢活性细胞数量显著增加，尤以ΔpslA pelF突变株为著。

Tn-bfmR突变株验证eDNA作用

Tn-bfmR突变株（eDNA高积累）的MBC-B值（44.4 μg/mL）显著高于PAO1 WT（16 μg/mL），且CFU计数显示其在高浓度NaOCl处理下存活率更高。这一结果进一步支持eDNA在生物膜抗性中的核心作用。

DNase处理揭示eDNA功能的基质依赖性

DNase I处理仅使ΔpslA pelF突变株的NaOCl敏感性增加（MBC-B降低57%），而对PAO1 WT无显著影响。早期（6 h）和成熟（24 h）生物膜中均观察到该趋势，表明外多糖Psl和Pel的存在可能保护eDNA免于降解，从而维持基质稳定性。

讨论

eDNA的释放机制涉及细胞裂解、膜泡形成和前噬菌体介导过程。NaOCl作为膜活性消毒剂，可通过诱导裂解促进DNA释放。本研究证实，eDNA在铜绿假单胞菌生物膜中充当物理屏障和信号分子，通过螯合阳离子、激活耐药相关操纵子（如PhoPQ-PmrAB）以及与多糖互作增强基质完整性，从而抵抗NaOCl引发的DNA氯化损伤和双链断裂。

外多糖Psl和Pel的缺失使eDNA的保护作用更为凸显，但同时也使其更易被DNase降解。这一发现揭示了EPS各组分的功能补偿效应：eDNA与多糖的协同互作可显著提升生物膜耐药性，而单一组分缺失时，另一组分的功能则更为关键。

结论与展望

本研究阐明eDNA是铜绿假单胞菌生物膜抵抗NaOCl氧化胁迫的关键因子，其作用强度取决于基质组成（尤其Psl/Pel的存在与否）。成果为靶向eDNA的抗菌策略（如DN酶疗法）提供了理论依据，但需进一步考虑生物膜生长阶段、DNA构型（如Z型DNA抗酶解）及多组分协同效应。未来研究应聚焦eDNA与RNA、多糖的交互网络，以全面解析生物膜耐药机制，推动临床、工业及环境领域抗生物膜技术的发展。