加拿大沙门氏菌环丙沙星耐药性的分子流行病学与计算机预测（2017-2022）：基因组学时代下的耐药机制解析与临床断点标准化挑战

　　本综述深入探讨了加拿大2017-2022年间人源和食源性沙门氏菌对环丙沙星的非敏感性（NS）分子机制。研究通过全基因组测序（WGS）和Staramr软件预测，发现gyrA突变（S83F/Y、D87N/Y）和qnrB19质粒介导耐药（PMQR）基因为主要机制。突破性发现：单一耐药机制既可能导致中介（I）也可导致完全耐药（R），无法通过机制数量区分CLSI的I/R断点。建议将环丙沙星I/R统一预测为"非敏感"类别，以促进全球公共卫生监测与治疗指南的标准化。

　　

Abstract

环丙沙星是治疗人类严重或侵袭性沙门氏菌感染的重要药物。随着实验室从表型检测转向基因组学方法来确定环丙沙星非敏感性，界定耐药遗传决定因素与表型结果之间的相关性变得至关重要。本研究检验了沙门氏菌中环丙沙星的耐药机制，并测试了以下假设：根据美国临床和实验室标准协会（CLSI）的折点，仅包含一种机制的分离株具有中介耐药性，而包含两种或更多机制的分离株则具有完全耐药性。在13750株人源和食源性/动物源性沙门氏菌分离株中，通过全基因组测序（WGS）和Staramr预测，有2325株对环丙沙星呈非敏感性。最常见的耐药机制是gyrA突变（尤其是S83F和D87N/D87Y）和qnrB19等位基因。仅有28%的环丙沙星耐药分离株拥有两种或更多耐药机制；其余仅包含一种机制。在拥有两种或更多机制的分离株中，仅63%为耐药表型。因此，在使用北美折点时，分离株中环丙沙星耐药遗传决定因素的数量无法可靠地区分中介或耐药类别。将环丙沙星中介/耐药预测为一个单一的非敏感类别，将有助于数据的全球标准化，从而为公共卫生监测、治疗指南和管理提供信息。

Introduction

沙门氏菌中的抗菌素耐药性（AMR）是一个日益增长的公共卫生问题。人类沙门氏菌病大多具有自限性；然而，严重和侵袭性感染可能需要抗菌治疗。环丙沙星属于氟喹诺酮类抗菌药物。世界卫生组织（WHO）已将氟喹诺酮类耐药沙门氏菌列为高度优先关注的病原体。环丙沙星非敏感性（中介/耐药）增加的趋势已在包括美国和加拿大在内的许多国家报道。氟喹诺酮通过结合DNA旋转酶和拓扑异构酶IV来抑制DNA合成。历史上，在沙门氏菌中，环丙沙星耐药性由编码DNA旋转酶和拓扑异构酶IV的基因（尤其是gyrA和parC）的喹诺酮耐药决定区（QRDR）突变所 confer。这些突变仍然常见，然而在过去20年中，质粒介导的喹诺酮耐药（PMQR）基因，如qnrB、qnrS和aac(6′)-Ib-cr的等位基因也已出现。这些PMQR基因编码小蛋白，结合并保护DNA旋转酶和拓扑异构酶IV免受氟喹诺酮抑制。CLSI提供了通过肉汤微量稀释法测定的环丙沙星最低抑菌浓度（MIC）的敏感（S）、中介（I）和耐药（R）类别的解释折点。加拿大公共卫生局等公共卫生机构已将沙门氏菌的AMR检测从肉汤微量稀释法转向基于全基因组测序（WGS）的AMR预测。WGS基于检测的一个主要优势是能够监测分子机制，以更精确地追踪耐药性的传播。

Materials and methods

加拿大抗菌素耐药性综合监测计划（CIPARS）是一个“一体化健康”监测项目，监测人类、患病和健康食用动物以及零售肉类中的AMR。CIPARS于2017年开始对人源分离株进行基于WGS的AMR预测，并于2019年开始对食源性/动物源分离株进行预测。本研究使用了分析时可用的所有数据，即2017年至2021年的6003株人源分离株和2019年至2022年的7747株食源性/动物源分离株。然后，我们进一步分析了来自人源（n = 1797）和食源性/动物源（n = 528）的具有环丙沙星非敏感性的沙门氏菌分离株亚组。根据CLSI，通过肉汤微量稀释法进行表型抗菌药物敏感性试验。环丙沙星的MIC根据CLSI折点进行解释：0.12–0.5 mg/L为中介，≥1 mg/L为完全耐药。加拿大公共卫生局开发了Staramr软件，利用WGS数据预测AMR，并已在肠沙门氏菌中得到验证。我们使用Staramr v0.7.0/0.7.1处理2017–2021年的分离株，使用v0.9.1处理2022年的分离株。我们通过将金标准（基于MIC数据的表型耐药）与基于Staramr的基因型预测进行比较，评估了分类AMR预测的敏感性和特异性。在13750株沙门氏菌分离株中，如果Staramr预测表型为“环丙沙星I/R”或“环丙沙星I/R，萘啶酸R”，则选择样本进行进一步分析（n = 2325）。使用Staramr结果的详细摘要部分，我们通过筛选预测表型为“环丙沙星I/R”或“环丙沙星I/R，萘啶酸R”的每个分离株的独特基因，确定分离株是拥有一种还是两种或更多耐药机制。

Results and discussion

沙门氏菌中环丙沙星非敏感性的比例在人源分离株中约为30%，在食源性/动物源中约为6.5%。当人源和食源性/动物源数据汇总时，环丙沙星非敏感性的总体比例约为16.5%。在通过WGS预测具有环丙沙星中介/耐药基因型的分离株（n = 2325）中，大多数分离株的环丙沙星MIC处于中介类别（n = 1922, 83%），而274株（12%）具有完全耐药性，129株（5%）为敏感（WGS假阳性）。尽管有5%预测为环丙沙星-I/R的分离株实际MIC属于敏感类别，但我们观察到AMR预测具有较高的总体一致性（98.5%）、敏感性（97%）和特异性（99%）。在1922株具有表型中介耐药性的分离株中，1881株（98%）仅有一种环丙沙星耐药遗传机制，最常见的是gyrA S83F/Y（n = 618, 33%）、gyrA D87N/Y（n = 767, 41%）和qnrB19（n = 299, 16%）。较少数的中介耐药分离株拥有两种或更多机制（n = 41/1922, 2%），携带gyrA突变和PMQR等位基因的组合（n = 35, 85%）、两个PMQR等位基因（n = 5, 12%）或两个gyrA突变（n = 1, 3%）。在274株具有表型耐药性的分离株中，大多数仅有一种机制（n = 198, 72%），最常见的是gyrA突变（n = 69, 34%）、qnrB19（n = 65, 33%）、parC S80I（n = 37, 19%）或qnrS1（n = 25, 12.5%）。在具有两种或更多机制的耐药分离株中（n = 76/274, 28%），大多数包含两个gyrA突变（n = 34, 45%）、一个gyrA突变和一个PMQR（n = 28, 37%）或两个PMQR等位基因（n = 14, 18%）。因此，仅有28%的环丙沙星耐药分离株包含两种或更多耐药机制。AMR预测假阳性结果（预测为中介或耐药但MIC处于敏感类别的分离株，n = 126, 5%）大多具有qnrB19（n = 42, 33%）、aac(6’)-Ib-cr（n = 31, 25%）或gyrB E466D（n = 25, 20%）。少数假阳性分离株拥有两种或更多机制（n = 3, 2%），且总是PMQR基因的组合。假阳性的发生可能是由于其他遗传或环境因素，例如有利于增加适应性的补偿性突变。在每个敏感、中介或耐药（SIR）类别中，最常见的基因/突变组合有所不同：耐药分离株中常见两个gyrA突变（n = 34, 45%），中介分离株中常见一个gyrA突变和一个PMQR（n = 35, 85%），敏感分离株中常见两个PMQR基因（n = 3, 100%）。这是一个总体趋势，但存在许多例外，因为我们的数据集中的沙门氏菌包含多样的耐药机制组合，产生了范围的MIC。总结加拿大环丙沙星耐药的分子流行病学，gyrA突变（尤其是S83F和D87N/D87Y）和qnrB19是 confer 环丙沙星非敏感性的最常见遗传机制。在大多数具有中介MIC的分离株中，gyrA S83F是最常见的基因型，而在耐药分离株中，gyrA S83F和qnrB19同样常见。gyrB突变很少观察到，并且gyrB E466D倾向于 confer 敏感类别的MIC。在美国，沙门氏菌环丙沙星耐药的分子流行病学与加拿大相似。PMQR的流行令人担忧，因为这些元件是可移动的，因此可能在细菌之间传播。在携带一个或多个PMQR等位基因的分离株中，qnrB19是最常见的，尤其是与gyrA突变配对时。美国和中国也报告了非伤寒沙门氏菌分离株中PMQR基因的出现。可移动的环丙沙星耐药性的出现令人担忧。关于分离株具有一种耐药机制对应中介MIC，而两种或更多机制对应耐药性的假设，我们的分析并不支持。对13750株沙门氏菌分离株（其中2325株预测为环丙沙星非敏感性）的分析表明，中介（n = 1881, 98%）和耐药（n = 198, 72%）分离株主要都只有一种机制。虽然拥有两种或更多耐药机制的分离株中有一小部分确实是耐药的（n = 76/120, 63%），但我们担心会漏掉耐药分离株。如果将一种机制的存在仅解释为中介耐药，那么72%的耐药分离株将被遗漏。遗漏耐药分离株可能导致错误的治疗选择，并低估公共卫生监测中的高水平耐药性。欧洲抗菌药物敏感性试验委员会（EUCAST）将环丙沙星耐药定义为≥0.12 mg/L，而CLSI将中介定义为≥0.12 mg/L，耐药定义为≥1 mg/L。因此，CLSI的I/R类别等同于EUCAST的R类别，在使用欧洲标准的国家中，区分I和R并非必要。CLSI指出，即使是中介的环丙沙星MIC也可能导致治疗失败。将环丙沙星I/R预测为一个单一类别有助于数据的全球比较，从而为全球公共卫生监测、治疗指南和管理指南（如WHO的AWaRE（获取、观察、储备）抗菌药物分类）提供信息。即使本研究观察到的预测值>97%，仍有一小部分WGS预测与MIC分类不一致。MIC检测仅在一到两倍稀释内准确，因此接近耐药折点的MIC结果可能导致分类错误。MIC和WGS结果之间不一致（假阳性或假阴性）的其他原因包括数据库不完整以及对所有可能导致耐药性的遗传因素（如启动子突变和外排泵）的认识不足。Staramr整合了来自基因组流行病学中心的数据库，包括用于获得性耐药基因的ResFinder和用于物种特异性染色体突变的PointFinder。然后，它利用这些遗传因素，基于先前由美国疾病控制中心策划的药物-基因关键表产生预测的抗微生物药物敏感性试验结果。Staramr和其他预测方法的一个局限性在于所使用的基因和突变数据库的特异性和完整性。其他类似的数据库和工具包括ResFinder网络工具、CARD、ARG-ANNOT、AMRFinderPlus和PATRIC。全球各地的公共卫生实验室采用各种方法学。虽然CARD非常全面，但其数据库尚未与临床耐药折点相关联，因此我们尚不能将其用于公共卫生监测。Staramr由加拿大公共卫生局创建，并在肠沙门氏菌中得到验证，显示基因型/表型一致性为99%。美国类似的沙门氏菌研究发现，使用ResFinder、CARD、GenBank中的独特基因和ARG-ANNOT组合的一致性为98.8%，使用AMRFinder的一致性为98%。研究发现外排泵与肠沙门氏菌中环丙沙星/喹诺酮耐药性之间存在联系。Staramr检测PMQR基因以及gyrA、gyrB、parC和parE突变；然而，它目前不包括外排泵，这是本研究的一个显著局限性。外排泵通常导致MIC的小幅升高；然而，与PMQR和/或gyr/par突变结合时，它们可能有助于将MIC提高到耐药折点以上。未来改进Staramr的方向可能包括使用CARD-RGI软件工具分析外排泵、孔蛋白或其他耐药基因或突变的变化，以及使用机器学习模型来提高预测准确性。

Acknowledgements

我们感谢为本研究做出贡献的三个国家监测计划团队的成员：加拿大抗菌素耐药性综合监测计划（CIPARS）、加拿大FoodNet和加拿大PulseNet。我们还要感谢国家微生物学实验室的基因组学核心设施、生物信息学核心设施、圭尔夫参考服务部门和肠道疾病部门提供的实验室支持。