BENDITA研究：苯硝唑在慢性恰加斯病中的群体药代动力学-药效学分析及与福司拉瓦康唑联合治疗的探索

　　本综述深入分析了BENDITA试验数据，揭示了苯硝唑(Benznidazole)在慢性恰加斯病(Chagas disease)治疗中的药代动力学(PK)特性及其与疗效的复杂关系。研究通过群体PK模型证实，福司拉瓦康唑(fosravuconazole)联合用药虽使苯硝唑清除率增加18%，但无临床相关性；性别对生物利用度的影响亦不显著。值得注意的是，标准8周疗程可能过度治疗，而4周日服或8周周服方案展现出相当疗效。然而，研究未能在苯硝唑治疗组内明确识别PK/PD驱动因素，凸显了优化给药方案仍需更大规模研究和更灵敏生物标志物的迫切需求。

　　

引言

恰加斯病（Chagas disease，CD）是一种被忽视的、慢性的、可能危及生命的疾病，由原生动物寄生虫克氏锥虫（Trypanosoma cruzi）引起。全球约有600-700万人被感染，另有7500万人处于风险之中。虽然最大的疾病负担在拉丁美洲，但日益增长的人口流动性已使恰加斯病传播到非流行地区，使其成为全球公共卫生问题。该病从通常无症状的急性期进展到慢性期，其血液中寄生虫密度极低。大多数个体保持无症状，但数十年后约三分之一出现严重的心脏或胃肠道并发症，导致显著的死亡率和发病率。

目前的治疗选择仅限于两种药物，硝呋莫司（nifurtimox）和苯硝唑（benznidazole），它们都是在半个多世纪前发现的，远非理想。苯硝唑常用，其机制可能涉及寄生虫硝基还原酶的硝基还原，产生活性中间体，破坏重要的生物学功能。尽管这两种药物在急性期都非常有效，但它们在慢性期的疗效——尤其是在成人中——以及阻止疾病进展的能力各不相同。治疗时间长（30-60天），并且常与药物不良反应（ADRs）相关，这些反应在成人中比儿童更常见。在所有研究中，约一半成年患者经历了不良反应，大多数为轻度至中度，只有不到1.5%被归类为严重。据报道，10-29%的患者停止治疗，主要原因是皮肤反应。然而，无国界医生组织的现场项目表明，通过密切的治疗监测，依从性得到改善，大多数患者完成了治疗，这突出了早期不良反应管理、患者咨询和随访的重要性。尽管如此，改进的治疗方案或具有更好耐受性的新治疗方法仍然迫切需要。

联合治疗被提出通过结合不同作用机制的药物来增强疗效和耐受性。唑类抗真菌药如泊沙康唑（posaconazole）和福司拉瓦康唑（fosravuconazole，拉瓦康唑的前药）抑制克氏锥虫固醇14α-去甲基酶（CYP51），该酶对膜完整性至关重要。虽然这些麦角固醇抑制剂在临床前研究中显示了抑制锥虫的效果，但它们在单药治疗试验中未能实现持续的寄生虫清除。然而，在小鼠模型中，将唑类药物与苯硝唑联合使用已显示出叠加或协同效应，为临床评估提供了理论依据。

最近的倡议集中在重新评估苯硝唑的给药方案，因为目前的方案依赖于有限的数据，并且最佳剂量、持续时间和频率仍不确定。一些研究表明，苯硝唑标准剂量5-8 mg/kg/天，持续60天可能过量，因此减少剂量可以在不损害疗效的情况下改善耐受性。替代策略，如较短的治疗持续时间、间歇给药、联合治疗和延长治疗时间，已在临床前研究和临床试验中进行了探索。

BENDITA试验由被忽视疾病药物倡议（DNDi）赞助，是一项2期临床试验，评估了成人慢性不确定性恰加斯病患者的各种苯硝唑给药方案。这些方案包括较短疗程、减少每日剂量，无论是作为单药治疗还是与福司拉瓦康唑联合，以及间歇性每周联合治疗。这些方案的疗效和安全性数据先前已有报道。尽管不良事件的总发生率在治疗组之间没有显著差异，但标准的8周方案（300 mg/天）因不良事件而停止治疗的比率最高。此外，中性粒细胞减少、白细胞减少和头痛在该组中报告频率略高。所有苯硝唑组均显示出比安慰剂更高的抗寄生虫反应。然而，苯硝唑剂量、血浆暴露与治疗反应变异性之间的关系仍然知之甚少。

在恰加斯病研究中建立药代动力学/药效学（PK/PD）关系对于指导剂量优化是必要的，但努力一直受到缺乏临床疗效和寄生虫学治愈的验证生物标志物的阻碍。由于血清转换通常需要数年时间才能实现，大多数最近的试验依赖于持续PCR阴性（通常超过一年）作为二元疗效终点。然而，PCR受到血液中寄生虫密度低、非常接近检测限（约1个寄生虫/10 mL）的限制。在先前的工作中，我们展示了二元PCR终点的局限性，并提出了概率解释以解决在这些低寄生虫密度下PCR结果的变异性。

在本研究中，我们基于BENDITA研究的数据进行了苯硝唑的PK/PD分析，以支持新治疗方案的评估。我们的具体目标是：i) 描述苯硝唑的群体药代动力学并研究与福司拉瓦康唑的潜在相互作用；ii) 探索苯硝唑暴露与寄生虫学反应之间的关系。我们使用qPCR阳性随访访视的比例作为非二元的药效学（PD）终点，区分单个、间歇性和一致的PCR阳性，以更好地描述个体治疗反应。通过表征PK/PD关系——同时考虑剂量、依从性和个体变异性——我们旨在增强对个体治疗反应和最佳抗寄生虫治疗的理解。

方法

临床数据

(i) 伦理声明。用于群体PK和PK/PD建模的数据源自先前已发表的BENDITA研究。该试验获得了以下伦理委员会的批准：Fundación Colectivo de Estudios Aplicados y Desarrollo Social (CEADES)伦理委员会（2015年11月30日），Universidad Mayor de San Simón医学院生物伦理委员会（2016年3月7日），以及SEDES Chuquisaca伦理与研究委员会（001/2016，2016年4月1日）。 further approvals were obtained from the Comité Etico de Investigación Clínica del Hospital Clínic de Barcelona (HCB/2016/0678) on 21-Sep-2016, and AGEMED (former UNIMED) – Competent Authority Bolivia (MS/UNIMED/CFN/042/2016) on 14-Apr-2016. 该试验根据当地法规、《赫尔辛基宣言》和《良好临床实践》指南进行。所有参与者在入组前提供了书面知情同意。该研究在ClinicalTrials.gov注册（NCT03378661），方案可在DNDi网站上获取。

(ii) 研究设计和研究对象。BENDITA是一项双盲、双模拟、安慰剂对照、随机、多中心、剂量评估、概念验证试验，于2016年至2018年在玻利维亚的三个专门恰加斯病门诊单位（科恰班巴、塔里哈、苏克雷）进行。共有210名成人（18-50岁，体重50-80公斤）患有慢性不确定性恰加斯病，经血清学检测和定性PCR结果阳性确认，被纳入研究。排除患有慢性健康状况以及有慢性心脏或消化系统恰加斯病体征或症状的受试者。

(iii) 治疗方案。参与者被随机分配到七个治疗组中的一个，包括六个活性治疗组和一个安慰剂组，每组30名受试者。活性治疗组（180名受试者）接受苯硝唑如下：苯硝唑150 mg每日两次，持续8周（标准护理）、4周或2周；苯硝唑150 mg每日一次，持续4周，作为单药治疗或与福司拉瓦康唑联合；以及苯硝唑300 mg（分两次剂量）每周一次，持续8周，与福司拉瓦康唑联合。苯硝唑或苯硝唑匹配的安慰剂片剂（Abarax, Laboratorios ELEA, Buenos Aires, Argentina）每天分两次口服（早上和晚上）。福司拉瓦康唑（Eisai Co, Ltd., Tokyo, Japan）口服给药，负荷剂量为300 mg每日一次，持续3天，随后300 mg每周一次，持续8周。

(iv) 随访访视和PCR。血液采样随访访视在第1-3天每天进行，然后在第2、3、4、6、10和12周进行，随后在第4、6和12个月进行。每次访视时，收集三份5 mL静脉血样本，并使用先前验证的定量实时PCR（qPCR）方法对克氏锥虫卫星DNA进行三重检测。寄生虫学反应根据qPCR结果定性确定，每次访视的总体结果如果至少有一个样本检测阳性则分类为“PCR阳性”。循环阈值（Ct）值是寄生虫密度的度量，代表每次研究访视时三个血样本三重检测的九个测量值的平均值。较高的Ct值表示较低的寄生虫密度（报告的最大值：40）。

(v) 苯硝唑的定量。用于药代动力学分析的稀疏全血样本在给药前和直至第10周的血液采样随访访视时获得（每位患者n=9个方案时间点）。药物给药时间和抽血的精确记录用于群体药代动力学建模。苯硝唑（和拉瓦康唑）在干血斑（DBS）中的浓度使用经过验证的液相色谱串联质谱法（HPLC-MS/MS）进行定量，根据良好实验室规范进行，如先前所述。简而言之，日内和日间精密度和偏差分别报告小于15%（n=9）和10%（n=27）。苯硝唑和拉瓦康唑的定量下限（LLOQ）分别为50 ng/mL和20 ng/mL。

药代动力学数据一致性评估

对个体苯硝唑DBS浓度-时间曲线的初步探索揭示了一些不一致之处。一些曲线的苯硝唑水平要么超过要么低于合理水平。例如，在给药后120小时（‘TAD [给药后时间] 异常值’）之后观察到苯硝唑水平高于LLOQ，这与苯硝唑报告的半衰期（~12-13小时）不符。因此，进行了系统且全面的异常值分析（详见S1文本）。通过PsN 5.2.6中的simeval和qa工具识别了额外的PK异常值，并辅以PK曲线的目视检查。审查了其他数据源（例如，ADaM文件、生物分析数据）以确保数据完整性并识别PK数据中的任何进一步异常或药物暴露的不确定性。

随后，考虑了这些异常现象的潜在原因——包括生物分析测定问题、不依从、生理变异性以及潜在的治疗分配错误——以告知关于将受试者纳入或排除后续分析的客观决策。如果观察到的浓度明显偏离其分配治疗的预期范围，但更接近替代方案，则受试者被标记为潜在分配错误。这些差异是通过基于初步群体PK模型在NONMEM中进行随机模拟来识别的。为每个方案模拟了1000名假设成人的苯硝唑浓度-时间曲线，并为每个PK采样时间点生成了99%置信区间（CI）。如果受试者与替代治疗组的差异少于与其分配组的差异，则被标记为潜在的治疗分配错误。考虑了记录在案的不依从和治疗中断。这些参与者，如果无法排除治疗分配错误的可能性，则被排除在所有分析之外。

群体药代动力学分析

(i) 模型开发。所有分配到活性治疗组的受试者都被纳入最终的PK分析数据集，除了那些被标记为潜在治疗分配错误的受试者。稀疏的苯硝唑DBS浓度汇集了所有六个活性治疗组。DBS浓度转换为自然对数，并使用非线性混合效应模型在NONMEM版本7.4.3中进行浓度-时间曲线建模。采用了带相互作用的一阶条件估计方法（FOCE-I）。模型构建过程和模型诊断借助于Pirana (v2.9.9)、Pearl-speaks-NONMEM (PsN v5.2)、R (v4.2.2) 和 TIBCO Spotfire (v 11.3.0) 进行。两个竞争性、嵌套模型之间的区分基于目标函数值（OFV），OFV的差异等同于似然比检验。结构模型的显著改进由OFV降低至少3.84（p < 0.05，一个自由度差异）表示。药代动力学数据在120小时TAD（约10个苯硝唑半衰期）处截断，并且对于截断的数据集，低于LLOQ的浓度被省略。

评估了一室和两室模型，以及不同的吸收模型（一级吸收和转运室模型）。相对生物利用度（F）在人群中固定为1，因为所有数据均来自口服给药，并且没有静脉注射数据来估计绝对F。个体间变异性（IIV）在F上被纳入基础模型，并且协变量效应——如性别——被建模为生物利用度的相对差异。IIV使用指数模型实现，最终模型中IIV估计值低于10%的固定为零。残留的无法解释的变异性在log转换的观察浓度上作为加性误差实现（相当于算术尺度上的指数残留误差）。

表现最佳的结构模型被用于后续的协变量模型构建。体重（标准化为65公斤）作为所有清除率（指数0.75）和容积（指数1）参数的全测量函数先验性地纳入。基于统计显著性和生物学合理性，评估了各种额外的人口统计学、药学和寄生虫学因素。个体肌酐清除率使用Cockcroft和Gault方程从血肌酐水平估计。预选的协变量（年龄、性别、累积苯硝唑剂量和每日剂量、药物治疗持续时间、单药治疗/与福司拉瓦康唑联合、肝/肾功能标志物、血细胞比容和血清学）通过逐步协变量建模方法进一步评估，使用PsN中的scm功能。对于连续协变量，探索了线性、指数和幂参数-协变量关系。在前向步骤中，协变量在统计显著性水平p=0.05（ΔOFV = -3.84）时被纳入，随后进行更严格的后向消除步骤（p=0.001，ΔOFV= -10.83）。

基本的拟合优度（GOF）诊断用于识别潜在的模型错误指定和系统误差。最终模型的预测性能通过预测校正的视觉预测检查（VPCs）进行评估。进行了自助法（n=1000个重采样自助数据集）以评估模型稳健性并获得参数精确度估计。

(ii) 暴露指标的定义。提取了以下个体PK暴露指标：苯硝唑在血液中的峰值浓度（C_MAX）和从时间零到无穷大的浓度-时间曲线下面积（AUC_∞）。估计了高于假定最低目标浓度的时间（T > IC₉₀），其中苯硝唑在血液中的IC₉₀设定为29.3 μM (7.61 mg/L)。该目标浓度基于苯硝唑对克氏锥虫（Tulahuen株）无鞭毛体形式的体外IC₉₀，校正了蛋白结合并换算到人血（DBS）样本。更多细节在S2文本中提供。还使用先前建议的治疗范围作为阈值（血浆中3-6 mg/L或DBS中2.5-5 mg/L）进行了敏感性分析，而不是IC₉₀。

除了这些暴露指标，苯硝唑治疗的持续时间以几种方式描述：苯硝唑治疗的总天数（实际服用苯硝唑的天数）；苯硝唑治疗的周数（如果每周至少服用一剂苯硝唑则计为一周）；以及苯硝唑治疗的总持续时间，不考虑间歇性药物中断。例如，如果一个随机分配到2周苯硝唑的个体只在第1天和第12天服用了活性治疗，这将记录为2个总治疗天数、2个治疗周和12天的总治疗持续时间。

治疗失败的评估

在这项回顾性分析中，任何治疗结束（EOT）时或EOT后任何随访期间阳性的克氏锥虫qPCR结果都被视为治疗失败的指标。EOT根据分配的治疗持续时间定义，允许最后一次活性剂量后有两周的宽限期。治疗失败在改良意向治疗（mITT）人群和符合方案（PP）人群中均有说明。mITT人群包括所有具有EOT后随访数据的参与者，不包括那些潜在治疗分配错误的参与者。PP人群进一步排除了苯硝唑依从性<80%的个体。依从性在个体给药场合水平评估，考虑了部分给药（例如，某天只服一剂而不是两剂）。

至少有一个治疗后qPCR阳性样本的患者比例按组总结，带有Clopper-Pearson 95% CI。使用Fisher精确检验（Holm调整p值）比较活性组与安慰剂组。由于该研究不足以区分活性治疗组，因此未在它们之间进行正式的统计比较。与原始的BENDITA研究不同，该研究通过排除特定访视（例如，2周组中的两次）来标准化治疗组之间的随访访视次数，我们的分析保留了所有可用的治疗后qPCR数据以支持PK/PD建模，特别是用于后续qPCR阳性率的计算。

暴露-寄生虫学反应分析

为了评估暴露-反应关系，使用了一个非二元的PD终点（qPCR阳性率），定义为EOT后克氏锥虫qPCR阳性血样本的比例。qPCR阳性率计算为每位患者的（阳性qPCR样本数 / EOT后总qPCR样本数）。分析在改良意向治疗（mITT）人群中进行。排除了没有EOT后随访或潜在治疗分配错误的参与者，但不被视为治疗失败，因为他们的治疗后状态无法评估。排除这些个体确保分析集中在具有可靠暴露和结果数据的参与者上。进行了排除额外PK异常值和暴露不确定个体的敏感性分析，以评估研究结果的稳健性。

使用R (v4.2.2)中的beta二项回归探索了mITT人群中苯硝唑血液暴露与qPCR阳性率之间的关系。该模型指定如下：logit(p) = β₀ + β₁x + β₂Ct_screen，其中p代表单次随访访视qPCR阳性的概率，logit(p)代表qPCR阳性的log odds。在方程中，β₀是截距，而β₁和β₂分别代表预测变量x和筛查访视（给药前）Ct值每增加一个单位，qPCR阳性log odds比的变化。研究了各种暴露变量（x）作为PCR阳性的预测因子，包括个体C_MAX、AUC_∞、T > IC₉₀和苯硝唑治疗持续时间。

至少一个随访样本qPCR阳性的概率，表示为p，根据单次随访访视qPCR阳性的概率(p)估计，如下：p= 1 - (1 - p)^N，其中N是随访访视次数。对一系列随访访视进行了预测，并利用了基线时的中位Ct值。

模型实现使用‘glmmTMB’包，beta二项分布参数化根据Morris 1997。在排除安慰剂数据和一名仅在8天内服用4剂的受试者后，使用R中GLM族的二项回归模型进行了亚组分析。该亚组分析不支持beta二项模型，并假设离散因子为1。模型诊断，包括过离散和零膨胀检验，以及模拟残差，使用R中的‘DHARMA’包进行。模型比较基于Akaike信息准则（AIC）。

结果

研究人群的特征

共有210名患有慢性不确定性恰加斯病的成人被纳入BENDITA研究，每组随机分配30名患者（图1）。在分析之前，进行了PK数据一致性的系统评估以评估其可靠性。按诊断标准和可能因果因素的不一致性细节在S1文本（S1.2和S1.3）中提供。对于大多数受试者，这些差异的具体原因仍不清楚。然而，五名受试者表现出观察到的和预测的苯硝唑浓度之间的显著差异，因此被排除在所有分析之外。治疗分配错误是一种可能的解释，但不能排除其他因素——如样本标记错误、不依从或测定错误。

最终的PK分析包括175名分配到活性治疗的受试者。四名患者没有EOT后随访数据并被排除，留下201名患者进入mITT人群（包括安慰剂）。PP人群包括183名患者，排除了那些苯硝唑依从性<80%的个体。对于PK/PD分析，在mITT人群的186名患者子集中进行了敏感性分析，排除了总共22名不符合PK/PD可靠性标准（例如，非归因于测定错误的PK异常值）的暴露不确定受试者。排除标准的更多细节在S1文本（S1.4）中提供。按治疗组划分的患者排除详细流程图见S1图。

整个BENDITA研究人群的基线特征和不良事件先前已有报道。此处，提供了纳入PK和PK/PD分析的受试者的人口统计学信息（表1）。所有患者均为玻利维亚人，年龄在18至50岁之间，中位体重65公斤（范围50-80公斤）。大多数患者为女性（70%女性，30%男性，mITT）。人口统计学和临床特征在各治疗组之间相似。

依从性受试者（服用至少80%分配苯硝唑剂量的受试者）比例在大多数研究组中超过90%，除了8周和2周治疗组，依从性约为80%。如先前报道，因不良事件而停止治疗在8周组中最常见（20%），其次是联合治疗组。因不良事件而治疗中断在2周组中最频繁（34%），但该组没有治疗停止。

药代动力学

纳入合并群体PK分析的175名患者贡献了986个DBS苯硝唑浓度，其中969个高于LLOQ（1.7% BQL）。

苯硝唑浓度-时间曲线最好通过一个转运室吸收模型来描述，随后是一个一室处置模型，并具有从中央室的线性消除（图2）。两室处置模型没有显著改善模型拟合。具有一个转运室的转运室吸收模型优于所有其他吸收模型。

体重作为所有CL/F（指数=0.75）和Vc/F（指数=1.0）参数的全测量函数被纳入，导致模型显著改进（?OFV = -34.7）。使用线性、指数和E_MAX函数研究了CL/F的潜在时间依赖性，如先前所述；然而，没有一个具有时变清除率的模型能显著改善模型拟合。福司拉瓦康唑的联合给药使苯硝唑清除率增加了18%（?OFV = -15.7）。此外，男性相对于女性的相对生物利用度有较低的趋势，估计男性生物利用度（F）低13%（?OFV = -15.5）。测试的其他协变量没有一个在后向消除协变量步骤后被保留。

最终模型的参数估计值及其相对标准误差和置信区间在表2中提供。平均转运时间（MTT）的变异性很高（62%变异系数，CV）。然而，自助法分析表明PK模型稳健，在估计PK参数方面显示出中等到高度的精确度（所有参数的RSE < 32%）。GOF图和预测校正的VPC如图3所示。最终模型准确地描述了观察到的浓度-时间曲线，没有主要的模型错误指定。敏感性分析，重新纳入五名具有严重PK异常值的受试者，显示PK参数估计值变化极小，证实了尽管存在潜在分配错误，PK模型仍具有稳健性（S1文本，S1.5）。

苯硝唑显示出快速吸收，中位达峰时间（T_MAX）范围从1.7到2.1小时。联合治疗组显示出比单药治疗组（~17小时）略短的消除半衰期（~14小时），这归因于福司拉瓦康唑联合给药对苯硝唑清除率的影响。AUC_∞和C_MAX值在男性中低于女性，反映了较低的相对生物利用度；然而，这种影响很小（<20%）。提供了不同活性治疗组苯硝唑的次要PK参数估计值，按性别分层（S1表）。

所选暴露变量的分布，未按性别分层，如图4所示。总暴露在各治疗组之间差异很大，标准治疗组（300 mg苯硝唑每日，持续8周）显示中位AUC_∞比每周组高7.9倍。AUC_∞表现出近似剂量线性，在单药治疗组（300 mg每日）中，比较2周与4周，以及4周与8周的治疗时，大约增加2倍。C_MAX在每日两次治疗组（11.7至11.9 mg/L）中比每日一次或每周治疗组（6.2至6.9 mg/L）高约两倍。

除了AUC_∞和C_MAX，治疗持续时间使用不同的定义进行了评估（S2a图）。以周计的持续时间（计算任何至少服用一剂的周）与总治疗持续时间（即持续时间，不考虑中断）高度相关。然而，在每周给药组中，这些参数与苯硝唑实际服用的总天数之间存在明显差异（见暴露指标相关矩阵S2表）。为了一致性，全程使用以周计的治疗持续时间（图4c）。

此外，还推导了高于目标浓度的时间，显示对阈值选择的高度敏感性（S2b图）。使用先前建议的治疗范围下限（血浆中3 mg/L，即DBS中2.5 mg/L），所有治疗组都实现了高于目标浓度的延长暴露。相反，使用体外IC<sub>90