反义磷酰二胺吗啉寡聚物（PPMO）有效清除伯克霍尔德菌复合体生物被膜的研究

　　本综述重点探讨了肽缀合磷酰二胺吗啉寡聚物（PPMO）在靶向Burkholderia cepacia complex（Bcc）生物被膜感染中的突破性应用。研究通过体内外实验证实，针对acpP基因的PPMO能高效穿透生物被膜结构，显著降低菌群负荷（>3-log，p<0.0001），并通过共聚焦显微术及扫描电镜（SEM）直观呈现其杀菌机制与细胞共定位特性。该策略为囊性纤维化（CF）等患者面临的耐药菌感染提供了新型治疗方向。

　　

背景

伯克霍尔德菌复合体（Burkholderia cepacia complex, Bcc）是一组革兰阴性、无芽孢的杆菌，包含至少20个遗传学 distinct 的物种。其中B. cenocepacia和B. multivorans是主要的人类病原体，常在免疫缺陷宿主如囊性纤维化（CF）和慢性肉芽肿病（CGD）患者中引起严重肺部感染。Bcc菌株表现出固有的抗生素耐药性，并且能够形成保护性生物被膜，这使得传统抗生素难以从定植的肺部根除它们。因此，迫切需要开发新的抗菌策略。

方法

本研究评估了靶向酰基载体蛋白（acyl carrier protein, AcpP）的肽缀合磷酰二胺吗啉寡聚物（peptide-conjugated phosphorodiamidate morpholino oligomers, PPMO）对Bcc临床分离株形成的 established 生物被膜的抗菌活性。通过最小抑菌浓度（MIC）测定、生物被膜减少试验（包括活菌计数、代谢活性检测和结晶紫染色）、扫描电子显微镜（SEM）以及共聚焦显微镜分析，研究了PPMOs的效果和机制。同时，使用人肺细胞系A549进行了细胞毒性试验。

结果

PPMOs减少已形成的生物被膜负荷

AcpP PPMO（AcpP-0077和AcpP-0791）处理导致五种Bcc临床分离株的生物被膜负荷减少超过3个对数级（p<0.0001），并表现出剂量依赖性效应（5–40 μM）。Scrambled序列对照PPMO（Scr-0394）与未处理对照组相当。代谢活性（resazurin assay）和总生物被膜质量（crystal violet assay）的量化进一步支持了这些发现。值得注意的是，流行株B. cenocepacia HI4277表现出对PPMOs的 decreased 敏感性，但通过每日给药（20–40 μM，持续7天），仍实现了>5.5-log的减少（p<0.0001）。

AcpP PPMOs破坏细菌细胞膜

扫描电子显微镜（SEM）分析显示，用40 μM AcpP-0077处理的B. multivorans SH-2生物被膜中，出现广泛的细胞膜裂解、细胞碎片和细胞外聚合物（EPS）残留，而未处理组和scrambled对照组则保持完整的细胞聚集和丰富的EPS。

AcpP PPMOs在生物被膜基质中与伯克霍尔德菌共定位

使用表达DsRed的B. cenocepacia K56-2菌株和荧光素标记的AcpP-0791 PPMO进行的共聚焦显微镜分析表明，PPMO在1、3和5小时的时间点内与细菌共定位（Pearson相关系数>0.5），证明Bcc生物被膜环境并不阻碍PPMO的递送。

PPMOs在杀菌剂量下无毒性

在人肺泡上皮细胞系A549中，浓度高达40 μM的AcpP PPMOs处理24小时后未观察到细胞毒性（通过LDH释放测定）。在60和80 μM时，细胞活力分别降低最多10%和30%，但所有Bcc菌株在非毒性剂量下均实现了多对数减少。

讨论

Bcc感染在CF和CGD患者中构成重大临床挑战，其固有的抗生素耐药性和生物被膜形成能力导致治疗困难。本研究证实，针对acpP的PPMOs在Bcc生物被膜 setting 中保留 potent 抗菌活性，通过多种机制包括膜破坏、细胞活力丧失和生物被膜减少发挥作用。共聚焦显微镜显示PPMOs与细菌细胞的共定位，表明生物被膜基质不是PPMO递送的 deterrent。尽管分子量较大，PPMOs可能借助其两亲性结构（中性PMO与带正电荷的肽缀合）穿透带负电的生物被膜环境。

菌株HI4277表现出相对耐药性，可能与 entry 机制有关，但通过持续每日给药得以克服。未来研究应关注PPMOs的体内毒性和治疗指数，特别是在肺部感染中的应用潜力。总体而言，PPMOs在克服Bcc生物被膜相关耐药性方面展现出 promising 治疗前景。