松针油活性成分乙酸龙脑酯通过抑制PI3K/AKT/ABCB1信号轴抑制非小细胞肺癌进展

　　本研究揭示松针油关键活性成分乙酸龙脑酯（BA）通过靶向抑制PI3K/AKT信号通路，下调多药耐药蛋白ABCB1（P-gp）表达，显著抑制非小细胞肺癌（NSCLC）细胞增殖、迁移侵袭并诱导凋亡，为克服化疗耐药提供了新型天然产物治疗方案。

　　

松针油活性成分乙酸龙脑酯（BA）通过抑制PI3K/AKT/ABCB1信号轴抑制非小细胞肺癌（NSCLC）进展的研究取得了重要突破。非小细胞肺癌作为全球癌症相关死亡的主要原因之一，尽管靶向治疗和免疫治疗改善了患者生存结果，但耐药性的发展严重限制了临床疗效。ATP结合盒（ABC）转运蛋白特别是ABCB1（也称为多药耐药蛋白1（MDR1）或P-糖蛋白（P-gp））的过表达是NSCLC多药耐药（MDR）的主要因素。ABCB1能够外排多种化疗药物（如紫杉醇、多西他赛、长春瑞滨），导致治疗失败。值得注意的是，ABCB1的表达和功能受到致癌信号通路的严格调控，其中高度激活的PI3K/AKT通路（NSCLC的常见特征）与ABCB1上调机制相关。

松针油及其活性成分分析

通过对松针油（PNO）进行全面的成分分析，采用硅胶色谱结合结构表征方法，总离子色谱图（TIC）显示了各组分的分离谱图。结构解析鉴定出关键化合物包括D-柠檬烯、乙酸龙脑酯（BA）、β-水芹烯、β-石竹烯、α-蒎烯、莰烯、β-蒎烯和α-松油烯。定量分析表明BA是一个可定义且一致的组分，占总PNO的3.1%（保留时间：27.562分钟；分子式：C₁₂H₂₀O₂）。

乙酸龙脑酯对NSCLC细胞的细胞毒性作用

使用CCK-8法评估了PNO及其八种活性成分对人NSCLC细胞（A549和NCI-H460）的细胞毒性作用。在相同浓度下，PNO及其成分对A549细胞活力的抑制效果不同，其中乙酸龙脑酯（BA）显示出最显著的效果和最低的半最大抑制浓度（IC₅₀）值（A549：106.9 μg/mL）。类似地，BA对NCI-H460细胞生长的抑制最强，IC₅₀值最低（NCI-H460：109.7 μg/mL）。剂量反应曲线和比较柱状图证实，BA在PNO成分中对NSCLC细胞具有最佳的抗增殖活性。乙醇载体在该浓度下对A549和NCI-H460细胞的增殖均无显著抑制作用。

乙酸龙脑酯抑制NSCLC细胞的侵袭、迁移和克隆形成

进一步评估了BA和PNO对A549和NCI-H460细胞的抗肿瘤作用。Transwell实验显示，与对照组和溶剂（乙醇，ETH）相比，BA和PNO显著抑制细胞侵袭和迁移。伤口愈合实验证实了BA和PNO诱导的迁移抑制。BA和PNO也显著减少了克隆形成。Western blotting显示，BA或PNO处理的细胞中cleaved-caspase 3水平升高，表明细胞凋亡诱导。这些结果表明，BA通过抑制侵袭、迁移和克隆形成介导显著的抗肿瘤作用。

乙酸龙脑酯抑制PI3K/AKT/ABCB1信号传导

为了阐明BA在NSCLC中的分子机制，使用RNA测序分析了BA处理前后A549细胞的转录组变化。BA处理的A549细胞的RNA测序鉴定出ABCB1的显著下调。KEGG通路富集提示ABC转运蛋白参与BA的作用机制。鉴于已建立的PI3K/AKT对ABCB1的调控，Western blot分析证实了BA介导的A549和NCI-H460细胞中p-PI3K(Tyr458)、p-AKT (Ser473)和ABCB1的抑制。

为了从药理学上逆转BA的作用，应用了特异性AKT激动剂SC79（10 μM）。Western blot分析评估了用SC79与BA联合处理的A549和NCI-H460细胞中PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT和ABCB1的表达水平。结果表明，SC79与BA共同处理导致p-AKT和ABCB1表达呈上升趋势。

为了进一步检查PI3K/AKT通路在BA诱导的ABCB1抑制中的参与，用AKT抑制剂Capivasertib（5 μM）单独或与BA联合处理A549和NCI-H460细胞，同时使用AKT激动剂SC79加BA。Western blot分析显示，Capivasertib单独下调ABCB1表达，而其与BA的组合产生协同抑制效应。相反，SC79激活AKT有效逆转了BA的抑制效应。

并行使用PI3K激动剂740 Y-P（20 μM）单独及与BA联合。Western blot结果表明，740 Y-P单独显著提高了p-PI3K、p-AKT和ABCB1的蛋白水平。此外，在联合处理下，PI3K激活显著抵消了BA介导的p-AKT和ABCB1下调。

此外，用PI3K抑制剂LY294002（10 μM）单独或与BA一起处理，导致p-PI3K、p-AKT和ABCB1水平显著降低。LY294002和BA的组合协同增强了这种抑制效应，表明PI3K抑制模拟了BA的细胞作用。总之，BA调节PI3K/AKT信号轴导致ABCB1下调，从而发挥其功能效应。

用AKT激动剂SC79进行的挽救实验部分逆转了BA诱导的侵袭、迁移和克隆形成抑制。用Western blot检测了用不同剂量AKT激动剂（SC79）处理的A549和NCI-H460细胞中PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT和ABCB1的表达水平。结果显示p-AKT和ABCB1表达增加，表明SC79成功激活了AKT。还检查了Caspase3和cleaved-caspase 3的表达，在SC79和BA存在下cleaved-caspase 3表达升高。这些证明了BA的抗肿瘤功能依赖于PI3K/AKT信号传导。

乙酸龙脑酯在体内抑制NSCLC肿瘤生长

为了评估BA和PNO的体内抗肿瘤功效，将2×10⁶个NCI-H460-荧光素酶细胞皮下注射到裸鼠的侧腹。随后，小鼠接受11.5 mg/kg BA、40 mg/kg PNO或盐水（对照组）的静脉注射。使用生物发光成像（BLI）密切监测肿瘤进展，并记录肿瘤荧光强度。结果表明，与盐水对照组相比，BA和PNO处理组的荧光强度显著降低。在实验终点，取出肿瘤进行组织学和免疫荧光分析。BA和PNO处理显著减小了肿瘤大小和重量。苏木精和伊红（H&E）染色显示，与对照组相比，处理组肿瘤组织内的坏死灶数量更多。ABCB1、Ki-67和TUNEL的免疫荧光染色显示，BA处理下调了ABCB1表达，降低了Ki-67表达，并增加了TUNEL表达。主要器官（心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏）的H&E染色显示相对正常的组织结构，表明没有明显的组织病理学毒性。肝肾功能评估显示，BA或PNO处理组的丙氨酸氨基转移酶（ALT）或天冬氨酸氨基转移酶（AST）水平没有升高。虽然血尿素氮（BUN）水平略有升高，但这种变化没有统计学意义。肌酐（Cr）水平保持不变。

在A549异种移植模型中也观察到一致的结果。BA和PNO处理显著减小了肿瘤大小和重量。H&E染色再次表明，与对照组相比，处理小鼠的肿瘤中坏死灶增加。免疫荧光分析证实，BA处理下调了ABCB1表达，降低了Ki-67表达，并增加了TUNEL表达。重要器官（心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏）的H&E检查显示相对正常的结构，没有显著的组织病理学毒性。肝肾功能测试显示ALT或AST水平没有升高，BUN水平略有但不显著的降低，BA或PNO处理组的Cr水平没有升高。这些发现共同证明，BA和PNO有效抑制NSCLC生长，并且在体内没有显著毒性。

讨论

NSCLL由于多药耐药（MDR）的频繁发展仍然是一个巨大的临床挑战，这通常由ABCB1/P-糖蛋白等外排转运蛋白的过表达驱动。天然产物提供了克服MDR的多靶点药物的丰富来源。在这里，我们确定BA作为PNO的关键单萜类成分，是NSCLC进展的有效抑制剂。我们证明BA在体外抑制增殖、侵袭、迁移并诱导凋亡，在体内抑制肿瘤生长。关键的是，通过全面的药理学调节（使用PI3K抑制剂LY294002、激活剂740Y-P、AKT激活剂SC79和抑制剂Capivasertib），我们确定BA主要通过抑制PI3K/AKT/ABCB1信号轴来发挥这些作用。

尽管靶向治疗（如EGFR-TKIs、ALK抑制剂）和免疫治疗（如PD-1/PD-L1抑制剂）近年来取得了进展，但耐药性的发展严重限制了它们的临床疗效。由遗传改变（如MET扩增）、表观遗传修饰和肿瘤微环境适应驱动的耐药机制大大降低了治疗效果。因此，迫切需要能够克服多药耐药的新药物。天然产物是此类药物的重要来源，当前NSCLC治疗方案中的紫杉醇和长春瑞滨就是例证。

先前的研究表明，PNO中的关键单萜类化合物乙酸龙脑酯（BA）通过抑制PI3K/AKT和MAPK/ERK通路，在肝癌和乳腺癌模型中通过抑制增殖和血管生成表现出抗肿瘤活性。然而，其在NSCLC中的作用尚未探索。本研究填补了这一关键空白，并证明BA作为PNO的关键活性成分，在NSCLC中发挥强大的抗肿瘤作用。BA显著抑制A549和NCI-H460细胞的活力、侵袭、迁移和克隆形成，并通过caspase-3切割诱导凋亡。

PI3K/AKT通路是NSCLC中肿瘤生存、增殖和治疗耐药的核心驱动因素。关键的是，该通路调节ATP结合盒（ABC）转运蛋白，包括ABCB1（P-糖蛋白），其通过药物外排介导化疗耐药。与先前的报告一致，我们证明PI3K/AKT的激活促进ABCB1表达。我们的RNA-seq分析显示BA下调ABCB1基因表达，而Western blotting显示同时抑制p-PI3K、p-AKT和ABCB1蛋白水平。使用AKT激动剂SC79的功能挽救实验初步证实了该轴的参与。为了进一步建立因果关系，我们利用了一组药理学工具。值得注意的是，PI3K抑制剂LY294002通过降低p-AKT和ABCB1水平模拟了BA的效果，而PI3K激活剂740Y-P显著减弱了BA诱导的这些蛋白的下调。这些发现提供了直接的功能证据，表明PI3K是BA作用的关键上游介质。此外，AKT抑制剂Capivasertib单独下调ABCB1，其与BA的组合产生协同效应，强调了AKT在这一调控级联中的核心作用。

从PNO和BA的功效谱中出现了有趣的比较。PNO的IC₅₀值约为500 μg/mL，而BA的IC₅₀约为100 μg/mL。鉴于BA仅占PNO的3.1%，其理论IC₅₀——如果它是唯一活性成分——应约为15.5 μg/mL（500 μg/mL × 3.1% = 15.5 μg/mL）。实验确定的BA的IC₅₀显著高于该计算值，表明尽管BA是鉴定出的最有效成分，但它可能不是PNO中唯一的活性化合物。在体内观察到的PNO的显著肿瘤抑制可能源于BA与其他成分（如β-蒎烯、莰烯或其他具有抗癌特性的单萜）之间的加性或协同相互作用。这种差异强调了天然提取物的复杂性，并暗示整个提取物可能具有超过单一化合物的治疗益处。需要进一步的研究来系统地检查BA与PNO其他主要成分之间的相互作用，以充分阐明其组成-活性关系。

尽管有这些令人信服的结果，我们的研究有几个局限性。首先，尽管药理学证据强烈支持PI3K/AKT/ABCB1通路的参与，但需要遗传功能获得和功能丧失研究来确定明确的因果关系。其次，虽然我们在蛋白质水平观察到ABCB1下调，但我们没有使用诸如钙黄绿素-AM积累测定等方法功能评估降低的泵活性。第三，使用的体外模型（A549和NCI-H460）并不直接代表EGFR突变或ALK融合阳性背景，其中克服TKI耐药最具有临床相关性。第四，我们的GC-MS分析的半定量性质和BA未检查的生物利用度突出了未来药物开发的重要领域。最后，虽然BA诱导了凋亡，但其对其他细胞死亡机制（如自噬）或DNA损伤反应的潜在影响仍未探索。

尽管PI3K的药理学调节剂（LY294002和740Y-P）有力地证明BA抑制PI3K/AKT/ABCB1通路，但这种方法不构成直接靶点验证。具体来说，我们的研究缺乏PI3K激酶活性的直接测量来最终证明BA酶抑制PI3K。因此，虽然我们的数据强烈暗示PI3K作为上游效应器，但我们不能排除BA通过替代靶点抑制AKT磷酸化的可能性。未来的研究使用直接酶测定和遗传操作（如PI3K过表达或siRNA敲低）对于确认因果关系和解释潜在的脱靶效应至关重要。

除了机制洞察，新化合物的转化潜力必须严格评估。尽管诸如AKT激动剂SC79和PI3K激活剂740Y-P等工具对于通路验证很有价值，但由于已知的脱靶效应（例如SC79诱导一氧化氮合成），它们不适合治疗使用。此外，BA的临床开发面临相当大的挑战。关键参数包括其生物利用度、药代动力学特征、最佳配方和人体安全窗口仍然 largely未知。这些方面代表了必须彻底研究的基本前提，然后BA才能被认真考虑用于治疗应用。

结论

总之，我们的研究提供了坚实的药理学证据，表明PNO的主要生物活性成分BA通过靶向PI3K/AKT信号通路并下调ABCB1表达来抑制NSCLC进展。在体外和体内模型中观察到的一致抗肿瘤效应强烈支持这一机制。这些结果不仅加深了对BA抗癌特性的理解，而且为研究ABC转运蛋白在治疗耐药性NSCLC中的调控奠定了基础。未来采用遗传操作和功能转运蛋白测定的研究对于全面描述这一通路和评估其治疗相关性至关重要。这项工作提供了BA在NSCLC中有效性的首个证据，并阐明了逆转耐药的新机制。我们的发现将BA定位为一个有前景的联合治疗候选物，具有在耐药性NSCLC中增强疗效同时降低毒性的潜力。未来的研究需要优化递送系统并评估BA与标准化疗药物联合使用的功效。