荷兰犊牛中超广谱头孢菌素耐药性大肠杆菌遗传多样性的纵向研究及其传播动力学解析

　　本研究通过纵向调查与全基因组测序(WGS)，揭示了荷兰犊牛中超广谱头孢菌素耐药(ESC-R)大肠杆菌的高遗传多样性及传播动态。研究发现blaCTX-M-1与blaCTX-M-15基因为主要耐药基因型，并鉴定出ST4981、ST2325等关键序列型(ST)，为控制耐药菌在畜牧业中的传播提供了重要分子流行病学依据。

　　

引言

荷兰自2009年起实施畜牧业抗菌药物减量化措施，成功将抗菌药物使用量减少77.5%，并全面禁用第三代和第四代头孢菌素。尽管抗菌药物使用量显著降低，但白肉犊牛中超广谱头孢菌素耐药性(ESC-R)大肠杆菌的携带率却从2015年的18.7%上升至2018年的49.5%。这一现象表明，在没有第三代或第四代头孢菌素选择压力的情况下，ESC-R大肠杆菌仍在犊牛中持续存在，亟需从奶牛场源头到育肥场的整个饲养过程中深入研究其传播动态和遗传机制。

材料与方法

2019年3月至2020年5月期间，研究人员开展了一项纵向研究，在13个荷兰奶牛场对683头犊牛在运输至8个育肥场前1天进行直肠拭子采样，并在育肥场到达后的第2、6、10、18和24周进行五次采样。通过使用头孢噻肟(1mg/L)的选择性培养基，共分离到1,202株ESC-R大肠杆菌。采用实时荧光定量PCR(RT-PCR)和扩增子测序技术检测ESBL/AmpC编码基因，包括bla_CTX-M-1群、bla_CTX-M-9群以及染色体bla_ampC基因启动子区的特异性点突变。对364株ESC-R大肠杆菌进行全基因组测序(WGS)，通过核心基因组多位点序列分型(cgMLST)分析菌株间的遗传关系。

结果

奶牛场和育肥场ESC-R大肠杆菌的携带频率与耐药基因分布

13个奶牛场中有9个检测到ESC-R大肠杆菌(n=175)，其中7个为高流行率农场(>50%)，2个为低流行率农场(<5%)。育肥场中，三个农场的ESC-R大肠杆菌携带率较高(38-84%)，其余五个农场较低(5-24%)。第二周时携带率最高(57.3%)。基因分析显示，bla_CTX-M-1和bla_CTX-M-15是奶牛场和育肥场中最主要的ESBL基因型，同时检测到与头孢菌素耐药相关的染色体AmpC启动子突变(C-42T)。

奶牛场ESC-R大肠杆菌的遗传相似性分析

对四个高流行率奶牛场的111株分离株进行WGS分析，发现多个遗传簇。DF2农场以携带bla_CTX-M-1的ST10、ST69、ST117和ST1123为主；DF7农场主要流行携带bla_CTX-M-15的ST4981和携带bla_CTX-M-32的ST714；DF10农场检出ST1245(bla_CTX-M-14)和ST744(bla_CTX-M-15)；DF11农场则全部为携带bla_CTX-M-15的ST2325。值得注意的是，ST4981菌株同时在DF7和DF10农场流行，但SNP分析表明它们属于不同克隆。

育肥场ESC-R大肠杆菌的遗传动态与传播特征

在高流行率育肥场VF6和VF7中，鉴定出多个优势克隆。VF6农场中，携带bla_CTX-M-15的ST617和ST4981在早期(第2-10周)占主导，而携带bla_CTX-M-1的ST101和ST2325在后期持续存在。VF7农场中，ST46(bla_CTX-M-15)成为绝对优势克隆，其中56株高度同源(SNP差异0-6个)。在低流行率农场VF1和VF8中，主要流行ST69、ST117(bla_CTX-M-1)以及ST46、ST2325(bla_CTX-M-15)。值得注意的是，在VF6农场检测到7株携带colistin耐药基因mcr-1的菌株。

耐药基因谱与个体动物定植动态

WGS预测显示，88%的分离株为多重耐药菌，携带对氨基糖苷类、氟苯尼考、磺胺类、喹诺酮类、四环素类、甲氧苄啶和氯霉素的耐药基因。对VF6和VF7农场中多次定植动物的分析显示，动物体内存在明显的菌株更替现象。95%的动物在饲养过程中经历了主要ESBL基因型的转换(bla_CTX-M-15与bla_CTX-M-1交替主导)。平均每头动物检测到4种不同的ESC-R大肠杆菌谱系，表明肠道内存在复杂的动态定植过程。

讨论

本研究通过高通量基因组学手段揭示了荷兰犊牛生产中ESC-R大肠杆菌的传播动态和遗传多样性。bla_CTX-M-1和bla_CTX-M-15是主要流行基因型，ST4981和ST2325是优势克隆型。研究发现一些在育肥场流行的克隆源自奶牛场，但由于荷兰饲养体系的特点(犊牛来源多样化)，育肥场最终呈现出高度遗传多样性的菌群结构。抗生素使用可能通过共选择机制促进多重耐药菌的传播。这项研究强调了纵向研究对于理解耐药菌传播动力学的重要性，为制定针对性的干预措施提供了科学依据。