秘鲁患病猪源副猪格拉瑟菌的基因组多样性、耐药性及毒力特征研究

　　本研究首次对秘鲁地区副猪格拉瑟菌（Glaesserella parasuis）进行全基因组测序分析，揭示了其高遗传多样性（含7种序列型ST和5种血清型），鉴定出携带多重耐药基因（ARGs）的移动元件和毒力相关基因（vtaA），为疫苗开发和疾病防控提供关键分子依据。

　　

1 引言

副猪格拉瑟菌（Glaesserella parasuis）是猪上呼吸道的早期定植菌，也是引起格拉瑟病（Gl?sser’s disease）的重要病原体，导致断奶猪出现多发性浆膜炎、关节炎和脑膜炎，造成高死亡率和严重经济损失。目前控制该病依赖于准确分型，传统血清学方法基于荚膜多糖将菌株分为15种血清型，并按毒力分为高毒力（如1、5、10、12、13、14型）、中等毒力（2、4、8、15型）和无毒力（3、6、7、9、11型）三类。但该分类仅基于参考菌株，田间分离株的血清型与毒力关联尚不明确。多位点序列分型（MLST）提供了更高分辨力的分型方法，目前已报道近900种序列型（ST），全基因组测序（WGS）则可全面解析菌株的 phylogeny、ST、毒力因子和抗菌素耐药基因（ARGs）。其中，毒力相关三聚体自转运蛋白（vtaA）基因（尤其是group 1 vtaA）被认为是最关键的毒力因子，而ARGs（如tetB、sul2、aph(3’)-Ia、bla_ROB–1）常通过移动遗传元件传播。尽管已有多种基因型和血清型被鉴定，但毒力与表型/基因型的相关性仍未明确。南美洲养猪业规模日益扩大，但针对该地区副猪格拉瑟菌遗传多样性的研究仍较缺乏。本研究旨在通过WGS技术分析秘鲁田间菌株的ST、血清型、ARGs和毒力因子，为疾病防控提供基础数据。

2 材料与方法

2.1 分离与鉴定

17株副猪格拉瑟菌分离自2021–2024年间秘鲁中部海岸9个养殖场（编码A–I）的患病猪临床样本（具体器官和农场信息见附表1）。分离培养采用含5%绵羊血和金黄色葡萄球菌ATCC 25923（提供NAD辅因子）的胰蛋白胨大豆琼脂，在37°C、5% CO₂条件下培养18–24小时，挑选透明非溶血且呈卫星生长的菌落。通过靶向infB基因的qPCR进行物种确认。

2.2 全基因组测序

使用Nanopore MinION平台（R10.4.1流动槽）进行测序，文库制备采用Native Barcoding Kit 24 V14。测序读长经Doraco v0.9.1碱基识别，Porechop v0.2.4去接头，Filtlong v0.2.1过滤（>2000 bp）。组装采用Autocycler流程（整合Flye、Canu、miniasm、NextDeNovo多种组装器），并通过Medaka抛光。组装质量经QUAST评估，注释使用Prokka完成。通过平均核苷酸一致性（ANI）分析（以Nagasaki株NZ_CP018034为参考）确认物种分类（ANI >95%）。

2.3 基因分型分析

血清型鉴定使用ABRICATE v1.0.1（自定义数据库覆盖15种血清型基因，阈值≥90% identity和≥80% coverage）。ST分型采用mlst v2.23.0（pubMLST数据库），新等位基因或谱系提交数据库分配ST编号。

2.4 系统发育分析

为纳入全球背景，额外下载216个公共基因组（Bioproject PRJNA749326），共233个基因组以Nagasaki株为参考通过Parsnp v2.1.3比对。去除重组区域后，使用IQTREE-2（GTR+Γ模型，1000次超快自举）构建最大似然树，ggtree v3.14可视化。

2.5 泛基因组分析

使用Panaroo v1.5.1（严格清洗模式，阈值0.98）分析234个基因组的泛基因组。基于 accessory gene（存在率5%–95%）进行主成分分析（PCA）。通过Scoary 2鉴定各进化支显著富集基因，eggNOG-mapper v2进行COG功能注释，Easyfig可视化基因上下文。

3 结果

3.1 完成17株菌的完整基因组组装

测序共产生364,714条修剪后读长，平均覆盖度155×（48–359×），所有菌株均获完整染色体（2.29–2.44 Mb，GC含量39.55–40.05%）。两株菌（GPS_LSR012和GPS_LSR013）携带3个小质粒（9461 bp、5673 bp和3789 bp）。

3.2 鉴定7种ST和5种血清型

共发现7种ST，其中6种为新ST（ST-725、726、727、773、848、849）。ST-727为ST-548的双位点变体（DLV），其余为 singleton。同一农场菌株多属相同ST，提示局部克隆传播。农场E贡献最多分离株（ST726 n=6；ST849 n=2）。ST-454分布于4个农场，显示较强传播能力。血清型包括12型（ST726、773）、4型（ST725、848）、7型（ST454）、2型（ST727）和6型（ST849）。

3.3 毒力基因与耐药基因

88.2%（15/17）菌株携带至少1个group 1 vtaA基因，最常见为vtaA1、vtaA3、vtaA6（各76.5%），vtaA4（70.6%），vtaA7（58.8%）。其他毒力基因：pilC（100%）、pilB（94.1%）、ompP5（88.2%）、bmaA4（88.2%）、bmaA5（82.4%）。

多数菌株（14/17）无ARGs。菌株LRS011（ST773）携带一个约50 kb基因组岛，含9种ARGs：bla_ROB–1（β-内酰胺类）、aph(3′)-Ia、aac(3)-IVa、aph(3′)-Ib（氨基糖苷类）、sul2（磺胺类）、tetB（四环素类）、lnuH（林可酰胺类）、estT（大环内酯类）、floR（氟苯尼考-酰胺醇类）。estT和floR基因存在串联重复（间隔IS30转座酶）。另两株菌（GPS_LSR012/013）的质粒携带tetH、estT和bla_ROB–1。

3.4 系统发育分析

基于核心基因组SNP的进化树将234株菌分为两大支（C1和C2），C2进一步分为C2.1和C2.2。秘鲁分离株分布于两支：9株属C1（含6株ST726-血清型12），8株属C2（含4株ST454-血清型7位于C2.1）。

3.5 泛基因组开放且支系间存在基因含量差异

泛基因组共4242个基因家族，核心基因（>99%存在）1467个（占34.6%），占平均基因组编码序列的69%。积累曲线（α=0.89）表明泛基因组开放。PCA显示C1与C2 accessory genome明显分离。

Scoary分析鉴定出C1支显著富集基因134个（74个获COG注释，主要属S未知功能、K转录、L复制重组修复类别）；C2支富集130个基因（99个注释，富集S、K、P无机离子转运、E氨基酸转运代谢类别）；C2.1支富集44个基因（主要属S、K、L类别）。值得注意的是，C2支特异性含有3个代谢操纵子：glnHMPQ（谷氨酰胺转运）、thiDEM（硫胺素合成）、hisGDCBHAFI（组氨酸合成），侧翼有插入序列（IS），提示水平转移来源。

4 讨论

格拉瑟病仍是全球养猪业重要疾病，精准诊断病原毒力、耐药性和血清型对防控至关重要。WGS为副猪格拉瑟菌的全面表征提供了有力工具。

本研究显示秘鲁菌株具有高度多样性（7种ST、5种血清型），6种新ST的发现印证了该菌遗传多样性高的特性。ST-454跨农场传播且与高死亡率相关，可能为优势克隆；ST-726同一农场多次分离提示其可能为地区新兴克隆。需更大规模采样以明确流行ST。

血清型7和12为优势血清型。当前秘鲁商用疫苗（Porcilis Gl?sser含血清型5；Hiprasuis Gl?sser含1和6型）对异源血清型保护有限，本研究数据可为自家苗菌株选择提供依据。

毒力基因分析显示绝大多数菌株携带group 1 vtaA，提示潜在致病性。C1和C2.1支菌株携带更多group 1 vtaA基因且多引起全身性疾病，但两株无vtaA基因菌株仍从临床病例分离，表明环境因素或共感染可能促使低毒力株致病。其他毒力基因（菌毛、孔蛋白等）广泛存在，但其与毒力关联仍需验证。

尽管多数菌株无ARGs，但一株菌携带含9种ARGs的大 cassette，且estT和floR基因串联重复（由IS30介导），基因扩增可能导致高水平耐药（类似金葡菌norA或mec扩增机制）。另两株菌质粒携带tetH、estT和bla_ROB–1，虽当前流行率低，但类似质粒已在其他巴斯德菌科中发现，需持续监测移动元件传播。

系统发育确认副猪格拉瑟菌分为C1和C2两大支系（C2再分C2.1/C2.2），泛基因组分析显示两支accessory gene存在显著差异。功能分析发现C2支特异性含有组氨酸、硫胺素和谷氨酰胺合成操纵子，而C1支可能为这些营养素的营养缺陷型。推测C1支可能适应于宿主特定营养丰富生态位（类似流感嗜血杆菌组氨酸缺陷型在喉部定植），但需实验验证该代谢差异是否影响致病性或宿主适应性。

5 结论

本研究揭示了秘鲁猪源副猪格拉瑟菌的高遗传多样性（涉及多血清型和新ST），检出携带多重ARGs的移动元件和多样毒力基因，强调需持续监测该病原传播。研究成果为自家苗开发和格拉瑟病防控提供分子依据。后续实验应验证C1与C2支系的代谢差异，以深入理解其致病机制和宿主适应性。