芬戈莫德增强氟康唑对耐药性耳念珠菌的协同抗真菌作用及其机制研究

　　本研究发现免疫抑制剂芬戈莫德（Fingolimod）可显著增强氟康唑（Fluconazole）对氟康唑耐药耳念珠菌（FRCA）的抗菌效果。通过棋盘法协同实验、生物被膜抑制（BIC）与清除（BEC）实验、XTT代谢活性检测及激光共聚焦显微镜（CLSM）观察，证实联合用药能有效抑制生物被膜形成并清除成熟被膜。qPCR分析表明该组合可下调耐药相关基因ERG11、外排泵基因CDR1及胞外基质基因KRE6的表达。研究为临床治疗多重耐药真菌感染提供了新策略。

　　

引言

耳念珠菌（Candida auris）是一种新发的重要医院内病原体，对重症监护病房中的免疫抑制患者具有高致死率，全球死亡率高达30%–72%。该菌具有较强的生物被膜形成能力和固有的氟康唑耐药性，被世界卫生组织列为关键优先真菌病原体。目前临床迫切需要针对氟康唑耐药耳念珠菌（FRCA）的新型治疗策略。芬戈莫德是一种经美国食品药品监督管理局批准用于治疗多发性硬化的免疫抑制剂，近期研究发现其具有抗菌活性，但其抗真菌作用及与现有抗真菌药物的联合效应尚未明确。

材料与方法

研究采用来自韩国国家病原体保藏中心的临床耳念珠菌分离株，通过微量肉汤稀释法测定氟康唑和芬戈莫德的最低抑菌浓度（MIC）。采用棋盘格实验评估两药的协同作用，计算分级抑菌浓度指数（FICI）。通过生物被膜抑制浓度（BIC）和生物被膜清除浓度（BEC）实验分析药物对早期生物被膜形成和成熟生物被膜的抑制作用。使用XTT还原法测定生物被膜内细胞的代谢活性，并通过激光共聚焦显微镜（CLSM）观察细胞存活状态。采用定量聚合酶链反应（qPCR）检测毒力相关基因（ERG11、CDR1、KRE6）的表达变化。

结果

MIC测定显示，芬戈莫德对临床耳念珠菌分离株具有较强的抗真菌活性，在4 μg/mL和16 μg/mL浓度下可抑制98%以上的真菌生长。根据EUCAST标准，NCCP32683、NCCP32640和KBN12P07096被鉴定为氟康唑耐药菌株。棋盘法实验表明，芬戈莫德与氟康唑联合使用具有显著协同作用（FICI ≤ 0.5）。针对菌株NCCP32640，16 μg/mL氟康唑与2 μg/mL芬戈莫德联用可抑制90%以上的真菌生长。

生物被膜实验显示，单用氟康唑或芬戈莫德对早期生物被膜形成的抑制率分别为17%和33%，而联合用药抑制率可达78%。对成熟生物被膜，联合治疗的清除率达到85%，显著高于单药处理。XTT实验表明联合处理使真菌代谢活性降低66%。CLSM结果直观显示联合用药后生物被膜中死细胞（红色荧光）显著增加，活细胞（绿色荧光）减少。

基因表达分析发现，联合用药使唑类耐药基因ERG11表达下调75%，外排泵基因CDR1表达降低81%，胞外基质相关基因KRE6表达抑制87%。

讨论

本研究首次报道芬戈莫德与氟康唑联用对FRCA的协同抗真菌作用。该组合通过破坏生物被膜结构、抑制真菌代谢活性和下调耐药相关基因表达等多重机制增强抗菌效果。值得注意的是，芬戈莫德在接近其MIC以下的浓度即可发挥协同效应，这为其临床转化提供了安全性依据。目前研究仍局限于体外实验，未来需进一步开展动物模型验证其体内效果及长期安全性，并探索其与其他抗真菌药物（如两性霉素B）的协同潜力。

结论

芬戈莫德可作为氟康唑的佐剂，显著增强其对氟康唑耐药耳念珠菌的抗菌活性。该联合策略通过抑制生物被膜形成、降低代谢活性和调控毒力基因表达等多途径发挥协同效应，为应对多重耐药真菌感染提供了新的治疗思路。