鼻内给予亚甲蓝（MB）通过增强线粒体功能与改善突触可塑性对大强度运动诱导的神经损伤发挥保护作用

　　本研究揭示鼻内给予亚甲蓝（Methylene Blue, MB）可显著改善力竭运动（Exhaustive Exercise, EE）大鼠的运动表现、减轻焦虑样行为并改善空间记忆能力。机制研究表明，MB通过抑制海马和纹状体区域的神经元凋亡（cleaved Caspase-3↑, TUNEL↑）、保护突触蛋白（Synaptophysin, Spinophilin）和髓鞘完整性（MBP↓），并减轻神经胶质过度活化（GFAP, Iba-1↑），最终改善线粒体形态碎片化（TOM20），发挥明确的神经保护作用。该研究为运动性中枢疲劳的干预提供了潜在治疗策略。

　　

引言

运动性疲劳通常由长时间或高强度的体力活动引起，可分为外周疲劳和中枢疲劳。力竭运动不仅导致肌肉损伤和心肺负荷增加，还可能诱发神经系统功能障碍，包括本体感觉失衡、暂时性行为异常和认知功能改变。这些症状与过度训练综合征密切相关，严重影响运动员的竞技表现和生活质量。因此，开发有效策略以缓解力竭运动对中枢神经系统（CNS）的负面影响已成为运动医学和神经科学领域的重点。

以往研究显示，力竭运动可导致特定脑区中促凋亡蛋白（如Caspase-1）表达增加，抗凋亡蛋白表达下降，进而诱发细胞凋亡。线粒体作为细胞的能量工厂，在调控氧化应激和维持动态平衡（包括线粒体分裂、融合和自噬）中起关键作用。力竭运动会损害线粒体功能，导致异常突触可塑性和神经功能缺损。此外，高强度运动还可激活小胶质细胞和星形胶质细胞，促进大量炎症因子分泌，加剧神经炎症。

海马和纹状体是CNS中至关重要的脑区。海马作为边缘系统的一部分，在学习、记忆和情绪调节中发挥核心作用；纹状体则参与运动控制、奖赏、动机和习惯学习。这两个脑区的生理改变可能是力竭运动引起不良神经后果的结构基础。

亚甲蓝（MB）最初作为染料使用，现已因其多样的生物学和医学功能被广泛研究。近年来研究发现，MB在脑缺血、阿尔茨海默病、帕金森病和创伤性脑损伤等多种神经疾病中表现出显著神经保护作用。MB可通过增强线粒体功能、减轻氧化应激和炎症、改善认知功能发挥效益。同时，鼻内给药可使小分子药物绕过血脑屏障，通过嗅神经和三叉神经路径直接到达脑部，实现中枢靶向治疗。MB兼具亲水性和亲脂性，能够有效穿透生物膜，因此非常适合鼻内给药。

本研究旨在探讨鼻内给予MB是否能够改善力竭游泳训练大鼠模型的神经元丢失、突触可塑性损伤和线粒体动力学异常，从而探索其在运动性疲劳中的神经保护潜力。

材料与方法

实验使用健康2月龄雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠，随机分为三组：对照组（不游泳）、力竭运动组（EE）和力竭运动+MB处理组（EE + MB）。所有动物在实验前经历14天适应期。力竭游泳训练在一个直径55厘米、水深50厘米的水桶中进行，水温维持在30°C ± 2°C。训练前进行3天适应性游泳（每日10、15、20分钟），随后进行连续10天的力竭游泳，每天至少2小时，动物尾部附加相当于体重3%的负重。

疲劳判定采用多指标“疲劳状态评分”系统，包括：持续完全浸没10秒以上、丧失协调运动控制能力（如身体明显扭转、后仰或无效前肢划动）以及出现持续可听“吱吱”声。累计得分≥2分即判定为力竭，立即终止游泳。

MB干预在每次力竭游泳训练后1小时进行。动物经异氟烷麻醉后，仰卧位接受鼻内滴注1% MB溶液（10 mg/ml），每侧鼻孔约10 μL，总量20 μL。对照组和EE组以相同方式给予等体积生理盐水。

在实验过程中记录大鼠体重变化，并于最后一次力竭游泳后实施一系列行为学测试，包括旷场实验（评估自主活动与焦虑）、高架十字迷宫（评价焦虑样行为）和Barnes迷宫（检测空间学习与记忆）。

实验结束后，迅速取脑组织。一侧半球分离海马和纹状体，-80°C保存用于蛋白质分析；另一侧经4%多聚甲醛固定、蔗糖脱水、OCT包埋后制备20 μm冠状冰冻切片，用于组织学与免疫荧光染色。

染色方法包括：甲苯胺紫染色（评估存活神经元数量）、免疫荧光染色（标记NeuN、Synaptophysin、Spinophilin、Iba-1、GFAP、MBP、Annexin V、cleaved Caspase-3和TOM20等分子）以及TUNEL法检测细胞凋亡。

数据采用SigmaStat软件进行统计分析。多组间比较使用单因素方差分析（ANOVA）及Tukey事后检验，重复测量数据采用双因素ANOVA分析。P < 0.05认为差异具有统计学意义。

结果

MB改善力竭运动大鼠的疲劳时间与体能状态

在训练第26天，EE + MB组大鼠力竭游泳时间显著长于EE组，显示MB处理可延缓疲劳发生、促进恢复。尽管体重变化在三组间整体趋势存在交互作用，但组间在单一时间点无显著差异，提示个体差异较大。

行为学测试显示，EE组在旷场中的穿线次数、总运动距离、平均速度和绝对转角均显著降低，冻结时间增加，表明其自主活动和探索行为受损。而MB干预显著逆转了这些行为缺陷，说明MB可有效改善力竭运动导致的体能下降和疲劳状态。

MB改善焦虑样行为与空间记忆能力

高架十字迷宫实验中，EE组进入开放臂的次数、比例及停留时间均显著减少，呈现明显焦虑样行为。MB处理则显著增加这些指标，提示其具有抗焦虑效应。

Barnes迷宫测试中，尽管三组动物在训练期寻找隐藏逃生盒的时间均逐渐减少，EE组与对照组、MB组之间无显著差异，说明力竭运动未引起明显空间学习障碍。但在探测试验中，EE组在目标象限停留时间显著缩短，呈现记忆缺损，而MB干预可显著改善这一缺陷。

MB抑制海马神经元丢失与凋亡通路激活

甲苯胺紫和NeuN染色显示，EE组海马CA1区存活神经元数量显著减少，细胞体积缩小、分布稀疏，出现核固缩和尼氏体模糊。MB处理则显著增加NeuN阳性细胞数，改善神经元形态。

进一步凋亡检测表明，EE组cleaved Caspase-3免疫活性和TUNEL信号显著增强，而MB处理显著抑制这两种凋亡标志物的表达。这些结果说明MB可通过抑制细胞凋亡保护海马神经元。

MB减轻纹状体神经元丢失与髓鞘蛋白损失

在纹状体区域，EE导致NeuN阳性神经元减少、髓鞘蛋白MBP表达下降、突触蛋白Spinophilin丢失。MB干预显著增加NeuN标记、恢复MBP表达连续性、提高Spinophilin水平。

凋亡检测显示，EE组cleaved Caspase-3、TUNEL和Annexin V信号均显著升高，MB处理则明显降低这些凋亡相关指标。证明MB在纹状体区域同样具有抗凋亡和神经保护作用。

MB抑制突触蛋白丢失

免疫荧光分析显示，EE组海马和纹状体中突触前蛋白Synaptophysin和突触后蛋白Spinophilin表达均显著降低，提示突触结构受损。MB处理可显著恢复这两种蛋白的表达水平，说明其能有效对抗力竭运动诱导的突触萎缩。

MB抑制神经胶质细胞过度活化

EE组海马和纹状体中的星形胶质细胞标志物GFAP和小胶质/巨噬细胞标志物Iba-1荧光表达均显著增强，表明神经胶质细胞被过度激活。MB处理显著降低GFAP和Iba-1的表达，抑制神经炎症反应。

MB改善线粒体形态

通过TOM20免疫荧光标记线粒体，并经ImageJ软件进行二值化处理分析，发现EE组海马和纹状体中线粒体碎片化加剧，总颗粒数、小颗粒（0–2 μm）数量显著增加，大颗粒（>3 μm）结构减少。MB处理显著减轻线粒体碎片化，保护线粒体形态完整性。

讨论

本研究系统评价了鼻内给予MB在力竭运动大鼠模型中的神经保护作用。结果表明，MB能显著提高力竭游泳时间，改善体能状态、焦虑样行为和空间记忆能力。从机制上讲，MB抑制了海马和纹状体中的神经元凋亡，减轻了突触蛋白损失和髓鞘破坏，抑制了胶质细胞过度活化，并改善了线粒体形态碎片化。

力竭运动作为一种高强度应激，可诱发类似缺血/再灌注的脑组织损伤，导致氧化应激、细胞坏死和凋亡。MB作为一种多效性药物，具有抗氧化、增强线粒体功能、抗炎和调节神经内分泌等多重作用，在本研究中表现出明确的神经保护潜力。

值得注意的是，MB通过鼻内给药实现了中枢靶向递送，兼具操作简便、剂量低、起效快、副作用小等优点，具有良好的转化应用前景。尽管该研究未检测氧化应激、炎症和激素水平等分子指标，且运动模型更接近急性应激而非生理性疲劳，但结果为MB在运动性中枢疲劳中的干预提供了有价值的基础证据。

未来研究可进一步探讨MB在不同剂量、给药时机以及运动前补充等方面的综合效应，并深入分析其与线粒体融合蛋白（如Mfn1、Mfn2）、自噬调节和能量代谢的关系，以全面阐明其神经保护机制。