载Contezolid Acefosamil（MRX-4）的β-磷酸三钙/硫酸钙复合材料对MRSA生物膜的抗菌效能、预防与杀灭作用研究

　　本综述系统评估了新型抗生素Contezolid Acefosamil（MRX-4）联合庆大霉素（Gentamicin）通过可降解载体硫酸钙（Calcium Sulfate, CS）和β-磷酸三钙/硫酸钙（β-TCP/CS）局部递送，在体外对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus, MRSA）生物膜的预防与杀灭效果。研究显示，MRX-4+庆大霉素（C+G）组合较传统万古霉素+庆大霉素（V+G）方案展现出更持久的抗菌活性（≥40天）和更强的生物膜渗透能力，尤其在已形成生物膜的根除方面表现显著优势（P<0.01）。该研究为开发针对慢性骨髓炎（Osteomyelitis）和糖尿病足骨髓炎（Diabetic Foot Osteomyelitis, DFO）的局部抗生素递送系统（Local Antibiotic Delivery Systems, LADS）提供了新策略。

　　

引言

骨髓炎是一种严重的骨骼感染性疾病，通常由细菌或微生物侵入骨组织引起，具有高发病率、长治疗周期和高复发风险等特点。其常见诱因包括创伤、术后并发症、血源性传播以及糖尿病等基础疾病。临床症状主要表现为局部疼痛、肿胀和瘘管形成，严重时可导致进行性骨破坏、畸形和功能丧失。糖尿病足骨髓炎（DFO）作为另一种广泛存在的骨髓炎类型，与糖尿病周围神经病变、微血管障碍和免疫功能减弱密切相关，是非创伤性下肢截肢的主要原因之一，严重影响患者的生活质量。

目前，骨髓炎的治疗主要依赖全身抗生素疗法与外科手术干预相结合的方式，包括清创术、死骨切除术、局部引流和缺损组织重建等。然而，感染骨组织的血液供应受损，限制了全身给药抗生素的疗效，尤其在慢性骨髓炎和糖尿病足感染案例中，由多重耐药（MDR）细菌形成的生物膜进一步增加了治疗难度。在这一背景下，局部抗生素递送系统（LADS）应运而生，其目标是在感染部位实现较高的局部抗生素浓度，提升细菌清除率，同时减少全身毒性反应。

在可用的LADS中，硫酸钙（CS）因其生物相容性、可生物降解性和骨传导特性而受到广泛关注。CS植入物可在降解过程中逐步释放抗生素，同时提供临时的骨再生支架。与传统的聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）骨水泥相比，CS可完全降解，无需二次手术取出，减少了患者的痛苦。此外，CS能够有效递送包括热敏感化合物在内的多种抗生素，且局部浓度较高，被认为是治疗骨髓炎和DFO的一种有前景的选择。

尽管如此，CS仍面临若干挑战。首先，其较快的降解速度可能超过骨组织再生的速度，导致CS吸收后仍存在感染风险。其次，尽管CS能够释放高浓度抗生素，但在慢性骨髓炎和MRSA相关感染中维持稳定且长期的抗菌效果尤为困难，因为生物膜的形成可保护细菌免受抗生素作用。研究表明，尽管抗生素负载支架在临床上广泛应用，但其对由革兰氏阳性细菌（如MRSA）引起的生物膜感染效力有限。此外，MDR细菌（包括MRSA和耐万古霉素肠球菌，VRE）的出现进一步增加了有效治疗的复杂性。这些问题凸显了对新型抗生素及联合疗法的迫切需求，以提升抗菌效力、确保持续的药物释放并改善骨髓炎的治疗结果。

MRSA是慢性骨髓炎和DFO的主要病原体，能够产生生物膜，在感染骨组织中持续存在并规避传统抗生素治疗。当前，万古霉素是治疗MRSA相关感染的一线抗生素，但其存在明显的缺点，如肾毒性、骨组织渗透性不佳以及在局部抗生素递送系统中释放时间较短。此外，万古霉素耐药现象日益增多，包括万古霉素中介金黄色葡萄球菌（VISA）和耐万古霉素金黄色葡萄球菌（VRSA）的出现，使治疗策略进一步复杂化。鉴于耐药性问题的紧迫性和对有效治疗的需求，开发具有更强抗菌效力、更优骨组织渗透性和更低耐药倾向的新型抗生素成为当务之急。

近年来，恶唑烷酮类抗生素因其独特的作用机制而逐渐被认为是治疗MRSA感染的有希望的选择。利奈唑胺作为首个获FDA批准的恶唑烷酮类药物，对多种多重耐药的革兰氏阳性细菌（包括MRSA、VRE等）表现出广谱抗菌活性。然而，其长期使用受到严重不良反应的限制，如骨髓抑制、周围神经病变和乳酸酸中毒，因此不适合长期治疗骨感染。这推动了具有更佳安全性和效力的下一代恶唑烷酮类药物的研发。

MRX-4（Contezolid Acefosamil）正是一种新型的第二代恶唑烷酮类药物。它是Contezolid的前体药物，可在体内外转化为MRX-1352，并进一步转变为具有抗菌活性的Contezolid（MRX-1）。MRX-1已获中国国家药品监督管理局（NMPA）批准用于复杂性皮肤和软组织感染（cSSTI）的治疗。研究表明，MRX-1具有较强的抗MRSA活性，是治疗骨感染的潜在候选药物。与利奈唑胺相比，MRX-1安全性更高、耐受性更好，血液学毒性更低，适合长期使用。此外，MRX-1具有广谱抗菌活性，覆盖MRSA、VRE和其他MDR病原体，进一步拓展了其临床应用范围。值得注意的是，MRX-4被设计为O-酰基磷酰胺酯前体药物，其水溶性显著提高，超过200 mg/mL，远高于Contezolid的约0.2 mg/mL，这有助于其通过生物膜的胞外聚合物（EPS）基质扩散。这种高溶解度可能使MRX-4更有效地穿透生物膜层，并在生物膜内部转化为活性MRX-1，实现局部抗菌效果。这种“前体药物扩散后生物激活”的机制为MRX-4在生物膜环境中优于标准恶唑烷酮类药物提供了合理解释。

目前，MRX-4正处于治疗糖尿病足感染的III期临床试验阶段，显示出对MRSA和其他MDR病原体的显著全身有效性。然而，其在骨组织中的局部应用尚未得到系统评估；关于局部抗菌性能、释放动力学以及与可吸收载体相容性的数据仍然有限。为填补这一转化研究空白，本研究探讨了将MRX-4（通过其活性代谢物MRX-1）与庆大霉素配对的可吸收局部策略。与先前的万古霉素或利奈唑胺负载载体相比，这种C+G方案具有以下优势：（i）通过MRX-1靶向细胞内核糖体活性，可能作用于代谢活跃的生物膜亚群；（ii）与庆大霉素的快速外层杀菌效应形成药理学互补，可能促进更深层的渗透；（iii）通过完全可吸收的硫酸钙（CS）或β-TCP/CS载体实现清创术后死腔内的持续局部释放。

因此，我们假设C+G通过CS或β-TCP/CS递送，在动态更新条件下优于万古霉素+庆大霉素（V+G）方案，能够更有效地根除已形成的MRSA生物膜。为此，我们在体外评估了持续抗菌活性、定量药物释放以及生物膜预防和根除效果，并比较了CS和β-TCP/CS载体的表现，以明确MRX-4在局部治疗骨髓炎和糖尿病足骨髓炎中的潜力。

材料与方法

细菌菌株与培养条件

本研究选用的标准金黄色葡萄球菌菌株为MRSA ATCC43300，源自实验室保存。复苏后的细菌接种于含10 mL胰蛋白酶大豆肉汤（TSB）的50 mL离心管中，半拧紧管盖，以45°角倾斜置于恒温摇床中，在37°C、200 rpm条件下培养16小时。

抗生素负载珠（ALBs）的制备

ALBs采用Genex和Stimulan Rapid Cure产品（Biocomposites Ltd.，英国斯塔福德郡）制备。Genex是一种由β-磷酸三钙（β-TCP）和CS按1:1重量比合成的双相材料，而Stimulan是一种高纯度CS产品。C+G和V+G组的混合比例分别为：800 mg MRX-4粉末（上海盟科药业股份有限公司）与240 mg庆大霉素粉末（天心药业，广东），以及1000 mg万古霉素粉末（礼来公司，美国印第安纳州）与240 mg庆大霉素粉末，分别与10 cc Genex或Stimulan粉末混合。CS或GENEX可用生理盐水稀释，与无菌盐水混合后3分钟内固化。我们在生物安全柜中将粉末彻底混合，加入4 mL无菌盐水。将光滑的糊状物压入具有4.8 mm宽半球凹陷的柔性模具中。等待完全固化后，选取珠粒并储存于4°C冰箱中。每颗珠粒重约0.108 g。

抗生素洗脱效能与对浮游细菌的抑制持续时间

采用改良的Kirby-Bauer试验评估ALBs随时间的抗菌效能。将MRSA（ATCC43300）的过夜培养物在TSB培养基中稀释至1%，取100 μL稀释液涂布于胰蛋白酶大豆琼脂（TSA）平板上。将三颗C+G或V+G的ALBs用无菌镊子等距放置于琼脂表面。平板随后置于37°C、5% CO₂的细菌培养箱中。抑制圈（ZOI）直径在24小时测量。细菌培养基每日更换，但珠粒保持不变。测量每个抑制圈的直径，并使用公式A = πr²计算相应面积，其中A为抑制圈面积，r为半径（测量直径的一半），π约等于3.142。当（i）抑制圈直径降至6 mm以下，表明检测不到抗菌活性，或（ii）残留珠粒直径因降解降至4.8 mm以下时，试验视为结束。

MRSA生物膜的预防

将ALBs和未负载抗生素的珠粒（每孔五颗）置于12孔板（Corning，美国纽约）和直径35 mm的共聚焦培养皿（Corning，美国纽约）中。每孔接种2 mL含10⁶菌落形成单位（CFU）/mL的TSB。培养皿置于细菌培养箱中，在37°C、5% CO₂和50 rpm条件下过夜培养。培养基每日更换。在1天和3天后观察生物膜细菌数量。

MRSA生物膜的杀灭

每孔接种2 mL含10⁶ CFU/mL的TSB，不添加ALBs。培养皿随后置于细菌培养箱中，在37°C、5% CO₂和50 rpm条件下过夜培养。培养基每日更换。3天后，加入ALBs和未负载的珠粒，培养皿返回培养箱中，在相同条件下再培养过夜。在1天和3天后观察生物膜细菌数量。

活菌菌落形成单位（CFU）计数

每孔用2 mL磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗两次，以去除浮游细胞。使用细胞刮刀（Corning，美国纽约）刮取孔表面，将生物膜细菌收集到1 mL PBS中。样品涡旋20秒以均质化生物膜细菌，进行十倍系列稀释后，采用滴板法在TSA琼脂平板上一式三份进行涂布。设不含珠粒的细菌接种培养基（对照组1，C1）或未负载珠粒（对照组2，C2）作为阴性对照。

共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）分析

为观察生物膜结构、细菌活力和处理效果，进行了CLSM分析。CLSM图像验证了CFU试验结果，直接提供了生物膜破坏和细菌存活力的证据。在生物膜预防试验中，对照组显示大片的绿色荧光，表明广泛的生物膜形成和存活细菌。而在抗生素处理组（C+G或V+G，CS珠粒），仅观察到少量分散的绿色斑点，死菌极少，表明有效的生物膜预防。在生物膜杀灭试验中，对照组再次显示大而密的绿色荧光，与存活的已形成生物膜一致。然而，在抗生素处理组（C+G或V+G，CS珠粒），观察到绿色（存活细菌）和红色荧光（死菌）混合，表明生物膜内部分细菌被杀死。绿色荧光显著减少，证实了生物膜的有效减少。此外，死菌似乎粘附于基质上，这在未处理的生物膜中未观察到，表明细菌根除发生在生物膜基质内部。在β-TCP/CS珠粒中也观察到类似结果，进一步证实载体选择对抗菌效能无显著影响。

统计分析

所有数据以均值±标准误（Mean ± SE）表示，并使用GraphPad Prism 8软件进行统计分析。对于两组间的比较，当样本量大于等于3且数据服从正态分布时，采用独立样本t检验。若方差齐，首先使用单因素方差分析（ANOVA）进行统计分析。若ANOVA结果具有统计学显著性，则进行Bonferroni事后检验进行两两比较。P值小于0.05视为具有统计学显著性，统计图表使用GraphPad Prism 8软件生成。本实验所有结果均来自至少三次独立的对照重复实验。

结果

抗生素洗脱效能与对浮游细菌的抑制持续时间

通过测量ZOI随时间的变化，评估了C+G和V+G从CS和β-TCP/CS珠粒中的抗菌效能和洗脱特性。ATCC43300菌株对两种抗生素组合均敏感。然而，V+G的ZOI逐渐减小，到第40天时接近零，表明其抗菌活性逐步丧失。相比之下，C+G的ZOI在14天后保持稳定，在整个观察期内波动在同一水平。即使在珠粒降解的最后阶段，C+G仍在持续释放 substantial 浓度，表明其具有持久的抗菌效果。此外，同一抗生素组合的CS和β-TCP/CS珠粒在ZOI上无显著差异。这表明两种载体材料为抗生素提供了相当的持续释放 profile，维持了其长期的抗菌效力。

生物膜形成的预防与已形成生物膜的根除

采用TSA琼脂滴注法进行CFU计数，以评估生物膜预防和根除效能。在生物膜预防试验中，对照组（无抗生素珠粒，C1；未负载珠粒，C2）表现出高细菌负载（10⁸–10⁹ CFU/mL）。相比之下，C+G和V+G处理组在第1天和第3天使生物膜细菌显著减少超过8个对数单位（P < 0.001）。无论使用何种抗生素组合，CS和β-TCP/CS珠粒之间均无统计学显著差异，表明两种载体在生物膜预防方面同等有效。

在生物膜根除试验中，对照组（C1和C2）在预形成的生物膜中再次显示高细菌负载（约10⁸ CFU/mL）。暴露于抗生素负载珠粒（C+G或V+G）1天后，生物膜内的细菌计数减少了约3–4个对数单位（P < 0.01）。第3天观察到类似结果，证实了两种抗生素组合的持续效力。值得注意的是，在第3天，C+G与V+G相比，对生物膜细菌的减少显著更大（P < 0.01），表明其具有更优的杀菌效果。此外，CS和β-TCP/CS珠粒之间无显著差异，进一步证明载体材料不影响抗菌效能。

CLSM生物膜分析

CLSM图像证实了CFU试验结果，直接提供了生物膜破坏和细菌存活力的证据。在生物膜预防试验中，对照组显示大片的绿色荧光，表明广泛的生物膜形成和存活细菌。而在抗生素处理组（C+G或V+G，CS珠粒），仅观察到少量分散的绿色斑点，死菌极少，表明有效的生物膜预防。在生物膜杀灭试验中，对照组再次显示大而密的绿色荧光，与存活的已形成生物膜一致。然而，在抗生素处理组（C+G或V+G，CS珠粒），观察到绿色（存活细菌）和红色荧光（死菌）混合，表明生物膜内部分细菌被杀死。绿色荧光显著减少，证实了生物膜的有效减少。此外，死菌似乎粘附于基质上，这在未处理的生物膜中未观察到，表明细菌根除发生在生物膜基质内部。在β-TCP/CS珠粒中也观察到类似结果，进一步证实载体选择对抗菌效能无显著影响。

讨论

骨髓炎的治疗需要包括外科清创、抗生素疗法和组织缺损重建在内的综合策略。其中，抗生素的适当选择和给药对于消除感染和预防复发至关重要。根据2020年骨折相关感染（FRI）国际共识，当前治疗FRI的金标准是早期经验性抗生素治疗结合LADS，然后根据微生物培养结果进行病原体定向治疗。尽管如此，尽管万古霉素和利奈唑胺广泛用于治疗MRSA相关的骨感染，但其效力日益受到抗菌素耐药性增加和相关不良反应的质疑。因此，寻找具有更佳安全性和效力 profile 的新型抗生素成为临床研究的紧迫任务。

在本研究中，利用MRSA生物膜模型评估了新型恶唑烷酮衍生物MRX-4的局部抗菌效能。采用β-TCP/CS和CS作为局部抗生素载体，并将MRX-4+庆大霉素与传统万古霉素+庆大霉素方案进行比较。结果表明，MRX-4+庆大霉素表现出显著的生物膜预防效果，明显减少细菌计数。此外，MRX-4显示出更优的生物膜渗透能力和持续抗菌效能，在根除预形成生物膜方面超过万古霉素，表明MRX-4可能具有通过EPS增强的扩散能力或对生物膜嵌入细菌的更强细胞内活性。考虑到生物膜形成是导致骨感染持续和复发的关键因素，这表明MRX-4可能在慢性骨髓炎和DFO的局部治疗中提供优于传统抗生素的治疗优势。

生物膜形成试验证实，MRX-4与庆大霉素的组合以及万古霉素与庆大霉素的组合均显著抑制了MRSA生物膜的发展。细菌CFU计数相较于对照组减少了约8个对数级，肯定了两种抗生素组合在阻止生物膜形成方面的有效性。然而，MRX-4在整个实验期间维持了稳定的抑制效果，表明其具有持久的生物膜预防属性，而万古霉素的效力减弱更快。此外，在生物膜根除试验中，MRX-4与庆大霉素组合在第3天时表现出显著优于万古霉素与庆大霉素组合的细菌减少，强化了MRX-4在根除已形成MRSA生物膜方面可能更具效力的假设。

MRX-4与庆大霉素组合的持久抗菌效能通过ZOI试验得到证实，表明MRX-4与庆大霉素配对能够维持其抗菌效能至少40天。相比之下，万古霉素与庆大霉素组合在15天后活性显著下降，到第40天时其效力几乎可忽略不计（P < 0.05）。这些发现提示，MRX-4在转化为其活性代谢物MRX-1后，促进了与生物材料降解同步的持续释放 profile，从而确保了局部抗生素浓度的长期升高。考虑到慢性骨髓炎案例中需要长期抗生素治疗，MRX-4提供的持续局部活性可能较传统万古霉素治疗具有临床益处。

从机制上讲，MRX-4/MRX-1在破坏和渗透MRSA生物膜方面优于万古霉素的原因可能源于其扩散和吸收特性的根本差异。万古霉素作为一种大分子糖肽，其在致密的生物膜EPS基质中扩散的能力有据可查地受限，通常需要高达浮游MIC数千倍的浓度才能实现 modest 的根除效果。相比之下，MRX-1（Contezolid）是一种更小、更亲脂的恶唑烷酮，能够相对更容易地扩散到生物膜内部。此外，已知恶唑烷酮类如MRX-1比万古霉素更有效地穿透细菌细胞，促进细胞内蛋白质合成的抑制——这一优势在于靶向生物膜嵌入的、缓慢生长的细胞（持久菌）。这些药效学区别——通过生物膜EPS的增强扩散和更优的细胞内活性——为MRX-4相较于万古霉素具有更优的生物膜渗透性和效力提供了更强的机制依据。在此基础上，将MRX-4与当前在局部递送系统中探索的其他抗生素进行背景化比较也很重要。利奈唑胺是另一种恶唑烷酮，已证明对MRSA生物膜有效，但其长期全身使用受到血液学和线粒体毒性的限制。MRX-4被专门设计用于在保持恶唑烷酮抗菌活性的同时提高安全性，从而允许延长给药。达托霉素则因其快速杀菌活性而受到重视，并已在骨靶向疗法中进行研究；然而，其在酸性或离子富集环境（如感染骨组织）中的效力会减弱，且在长期治疗中可能出现耐药性。相比之下，MRX-4结合了相对于利奈唑胺的安全优势、持续释放 profile 和可靠的生物膜渗透能力，突显了其作为下一代药物在MRSA骨髓炎局部抗生素递送中的前景。

为评估抗生素载体选择对抗菌效能的影响，采用了β-TCP/CS和纯CS。研究结果表明，载体类型对抗菌效果无显著影响。β-TCP/CS和CS均实现了持续的抗生素释放，并在生物膜抑制和根除方面产生了可比的结果，这与先前证明CS基载体在局部抗生素递送中有效的研究一致。此外，β-TCP可能为骨再生提供额外支持，使其成为骨缺损管理中的优选方案。然而，其较高的成本限制了其广泛的临床应用。此外，本研究还将MRX-4+庆大霉素与单药治疗进行了比较，数据表明联合疗法表现出更优的抗菌效能。这一效应可能源于庆大霉素抑制细菌蛋白质合成的能力，从而增强了MRX-4介导的细菌清除。此外，庆大霉素的高水溶性有助于改善载体内的抗生素扩散，优化了MRX-1的局部生物利用度。基于这些结果，选择庆大霉素作为协同剂以增强MRX-4在生物膜靶向治疗中的效力。

尽管本研究强调了MRX-4作为MRSA相关骨感染局部治疗的潜在效力，但必须认识到若干限制。首先，研究仅限于3天的观察窗口，未进行更长期的评估，如7、14或30天。尽管ZOI试验证明抗菌效能可持续长达40天，但仍需进一步研究以确定MRX-4是否在更长时间内持续发挥其生物膜破坏效应。未来的研究工作应包括更长期的体外和体内实验，以评估MRX-4在慢性感染中的长期效力。此外，本研究仅在体外利用MRSA生物膜模型进行；然而，体内骨感染涉及更多变量，包括宿主免疫反应、血液供应和局部pH波动，这些都可能影响抗生素效能。特别是，骨髓炎是一种高度复杂的病理状态，涉及动态的宿主-病原体相互作用、骨重塑过程和抗生素的全身药代动力学，这些在我们的体外生物膜模型中均未充分重现。这些因素可深刻影响药物渗透、局部效力和临床治疗结果，因此强调需要进行精心设计的体内研究以捕捉骨感染的多方面性质。另外，本研究未探讨MRX-4在骨组织中的潜在毒性或生物相容性问题。鉴于局部递送系统必须平衡抗菌效力与宿主组织相容性，未来研究有必要调查MRX-4与成骨细胞、破骨细胞和周围骨基质的细胞相容性，以确保其临床转化的安全性。因此，为更全面了解MRX-4的治疗潜力，建议建立慢性骨髓炎和糖尿病足感染的动物模型，以验证其药代动力学和临床适用性。最后，尽管MRX-4与庆大霉素配对进行了评估，但研究未探索其他协同抗生素组合，如涉及利奈唑胺或达托霉素的方案。鉴于MRSA生物膜的复杂性，未来研究应检查更多抗生素组合，以优化局部治疗方案并减轻耐药性的出现。

总体而言，本研究证明了新颖且重要的发现：MRX-4与庆大霉素组合在预防和根除MRSA生物膜方面均表现出高效力，突显了其作为治疗骨髓炎和糖尿病足骨感染的新型局部治疗剂的潜力。重要的是，MRX-4显示出持续释放 profile 和更优的生物膜渗透能力，这明显将其与万古霉素区分开来，并强调了其作为局部抗生素递送系统中下一代替代药物的前景。此外，我们的结果首次证明β-TCP/CS和CS均是MRX-4递送的有效载体，从而拓展了其在传统药物之外的临床应用潜力。这些发现代表了在开发针对生物膜相关骨感染更有效局部策略方面迈出的有意义的一步。尽管如此，鉴于实验时间较短且缺乏体内验证，进一步的长期研究和动物实验对于全面确立MRX-4的临床效力和安全性至关重要。因此，未来研究应聚焦于延长治疗时间、探索替代抗生素组合以及进行体内药代动力学评估，以优化基于MRX-4的局部疗法用于慢性骨感染。

结论

本研究证明，MRX-4与庆大霉素组合，通过可生物降解的CS和β-TCP/CS载体递送，有效预防和根除了MRSA生物膜，同时维持了至少40天的持续抗菌活性。与万古霉素+庆大霉素相比，MRX-4表现出更优的生物膜渗透能力和更持久的抗菌效果，使其成为局部治疗骨髓炎和DFO的有前景的替代方案。CS和β-TCP/CS均被证明是有效的抗生素载体，支持稳定的药物释放。这些发现突显了MRX-4在局部抗生素递送中的潜力，值得进一步研究以验证其长期效力和临床应用。