胶质瘤化疗耐药性与膜电生理特性及糖基化的关联研究 中文标题

　　本综述深入探讨了胶质瘤细胞对替莫唑胺（TMZ）的耐药机制，揭示了细胞膜电生理特性（如膜电容）和糖基化修饰（N-糖基化）在耐药性中的关键作用。研究通过介电泳（DEP）技术实现了耐药细胞的非标记分选，为胶质母细胞瘤（GBM）的精准治疗和耐药机制研究提供了新策略（如HOAPES-3分选装置、IC50测定）。

　　

Abstract

弥漫性胶质瘤（包括少突胶质细胞瘤、星形细胞瘤和胶质母细胞瘤GBM）是最常见且致命的原发性脑肿瘤。治疗的主要挑战在于其对一线化疗药物替莫唑胺（TMZ）的耐药性。尽管细胞膜是细胞与环境的首要接触点并显著影响细胞行为，但耐药细胞的质膜特性尚不明确。研究发现TMZ耐药细胞的糖基化模式存在显著差异，并进一步通过膜电生理特性预测了耐药性。通过基于电生理特性的分选，成功富集了高耐药性细胞，表明膜特性与化疗耐药直接相关。这些发现有望推动患者肿瘤细胞的快速分离技术、耐药细胞分子谱的解析以及新型治疗策略的开发。

Translational Impact Statement

脑癌（如胶质瘤）因存在治疗耐药细胞而极具致命性。表征这些耐药细胞对理解耐药机制和开发新疗法至关重要。本研究揭示耐药胶质瘤细胞在质膜糖基和电生理特性上存在差异，并利用电生理差异富集耐药细胞。这种新型细胞富集方法为鉴定生物标志物和耐药机制提供了基础，最终促进更有效的胶质瘤治疗。

1 INTRODUCTION

弥漫性胶质瘤浸润周围神经组织，类型包括少突胶质细胞瘤、星形细胞瘤和GBM。GBM是最常见的原发性脑肿瘤，美国年发病率约13,000例。尽管采用手术、放疗和化疗，其中位生存期仅约9个月。

TMZ耐药是主要问题。初始响应TMZ的患者常复发，且后续治疗失败，因缺乏替代方案而生存期受限。耐药机制涉及多种细胞因子，如DNA修复酶、膜转运蛋白、自噬相关蛋白和间充质程序激活。耐药可能由治疗中获得的de novo突变引起，或源于治疗前已存在的固有耐药细胞。多项数据表明TMZ耐药细胞常具癌症干细胞特性，驱动肿瘤复发。

耐药细胞表达的质膜成分介导与肿瘤微环境的相互作用，可能助力耐药并提供检测与富集手段。因此，研究耐药细胞质膜组成对理解耐药机制至关重要。细胞表面糖基化（糖链与膜蛋白和脂质连接）是重要的质膜修饰，调控膜蛋白功能、表面定位和配体亲和力。糖基化调节多种表面蛋白（如生长因子受体、黏附蛋白和膜转运蛋白），可能深刻影响胶质瘤耐药。

质膜电生理特性受糖基化影响。在神经干细胞中，扩增复杂细胞表面糖链可增加膜电容并改变细胞命运，表明糖基化对细胞功能的影响。通过介电泳（DEP）可快速评估大量活细胞的质膜电生理特性。DEP利用非均匀电场诱导细胞基于内在特性移动，无需细胞类型特异性标记。DEP可测量细胞膜和胞质电生理特性，并基于电生理差异分离细胞。重要的是，DEP在短时间内对多数细胞无毒，故可分选活细胞进行下游分析。

DEP能检测和分离表型差异细微的细胞。例如，命运偏向不同的神经干细胞可通过DEP富集，因其全细胞膜电容（反映膜储电荷能力）不同。膜电容是细胞表型的稳健标志物，在多能干细胞系（神经、造血、间充质/脂肪来源和胚胎）中区分不同命运细胞。

开发快速识别和分离患者肿瘤中TMZ耐药细胞的新方法，将促进对其分子特征、耐药机制和治疗策略的理解。常规富集耐药细胞需长期TMZ培养筛选，但此过程耗时（数周至数月），且 prolonged TMZ暴露可能诱导与耐药无关的细胞变化，或无法反映原生微环境中的耐药表型。因此，需要替代策略以快速富集TMZ耐药细胞，避免长期培养。

为探索质膜对TMZ耐药的贡献，研究检测了TMZ耐药细胞是否具有独特糖基化模式，以及能否通过电生理特性识别和富集。

2 RESULTS

2.1 Cell surface N-glycans differ between TMZ-resistant and control glioma cells

既往研究发现神经干细胞分化与细胞表面N-糖基化相关。由于糖基化调控多种可能影响耐药的质膜蛋白，研究评估了TMZ耐药胶质瘤细胞的糖基化。采用D54和U251 GBM细胞经TMZ培养筛选耐药细胞（D54-TR、U251-TR），与未用TMZ的对照（常规培养基或DMSO培养基）比较。长期TMZ培养显著增加了D54和U251细胞的TMZ耐药性。

通过凝集素流式细胞术检测常见细胞表面N-糖链：ConA（高甘露糖）、E-PHA（平分型）、DSL（β1–4分支）、L-PHA（β1–6分支）、LEA（N-乙酰乳糖胺）、LCA（核心岩藻糖）、AAL（外侧岩藻糖）、SNA（末端唾液酸）。平均荧光强度（MFI）分析显示，与对照相比，两种GBM细胞系的TMZ耐药细胞中E-PHA、DSL和AAL结合均显著降低，表明耐药相关糖基化变化具有一致性。LCA结合在D54-TR细胞中显著升高，但在U251中相反。SNA结合在U251-TR中显著降低，而D54-TR无差异。因此，核心岩藻糖（LCA检测）和唾液酸（SNA检测）与TMZ耐药无跨细胞系一致性。

MFI反映整个细胞群体。为测量高或低凝集素结合细胞的比例，利用对照细胞直方图将细胞分为低表达和高表达亚群。定量TR细胞在高表达门中的百分比，结果与MFI分析相似。D54-TR细胞中E-PHA、DSL和AAL高表达群体减少，但LCA增加。U251-TR细胞在E-PHA、DSL和AAL上趋势相同，但LCA高表达群体减少。总之，D54-TR和U251-TR细胞均显示E-PHA、DSL和AAL凝集素结合降低，表明平分型和分支型N-糖链以及外侧岩藻糖修饰与TMZ耐药相关。

2.2 TMZ-resistant glioma cells have distinct electrophysiological properties

既往研究发现神经干细胞在表面N-糖基化差异的同时，全细胞电生理特性也不同。研究采用交流DEP在频率范围内测量对照和TMZ耐药细胞的全细胞电生理特性。细胞在DEP中经历频率依赖性诱导力，导致排斥（负DEP）或吸引（正DEP）。

低频DEP响应由质膜特性主导，高频由胞质特性主导。若两细胞因固有特性对DEP响应频率不同，可选择一频率使一细胞经历正DEP、另一为负DEP，从而基于TMZ耐药性分离细胞。

DEP谱反映细胞在不同电场频率下的移动。使用3DEP分析仪测量对照和耐药细胞的DEP谱，发现耐药细胞（D54-TR、U251-TR）与对照（D54、U251）的谱图不同。从DEP谱可提取全细胞电生理特性，如膜电容（储电荷能力）、膜电导（传电荷能力）和中点频率（细胞类型特异性频率响应）。发现TMZ耐药细胞的膜电容值显著低于对照。中点膜频率（质膜主导）在耐药细胞中显著更高。膜电导值无一致差异。中点胞质频率无差异。

这些数据表明，TMZ耐药细胞可通过膜电容和中点膜频率区分，且DEP可用于富集耐药细胞。

2.3 Parameter optimization for DEP-based sorting of glioma cells

DEP分选需细胞在高渗透压、低电导缓冲液中悬浮。测试了D54细胞在DEP缓冲液中的存活率，发现除最高电压（10 V）和最长暴露时间（5 min）外，所有条件下细胞存活率均>80%。

测试了用于鼠和人神经干细胞分选的DEP缓冲液。细胞在缓冲液中孵育达6小时（分选最大时间），并检测温度（冰上或室温）对存活率的影响。所有样本显示高存活率（>80%），表明缓冲液无急性毒性。

但缓冲液孵育后细胞恢复不佳，图像显示细胞数减少和死亡增加。令人惊讶，因神经干细胞在此缓冲液中存活良好。测试缓冲液孵育时间发现，2小时即导致D54细胞数减少和死亡增加。

注意到细胞在室温培养基中孵育6小时存活最佳，图像显示细胞簇，表明细胞-细胞接触可能改善存活。既往研究发现人胚胎干细胞存活需细胞-细胞接触，添加ROCK抑制剂（ROCKi）可提高解离细胞存活。在DEP缓冲液中添加ROCKi（1–10 μM）发现5 μM ROCKi可维持高D54存活。ROCKi加入显著改善D54急性及长期存活。测试另一种含钙镁的RBC-DEP缓冲液，但未提高存活。

测试ROCKi是否改变影响DEP分选的细胞参数。测量膜电容和细胞大小，发现添加5 μM ROCKi未改变D54膜电容值或大小。为模拟分选条件，细胞在含ROCKi的DEP缓冲液中孵育6小时后铺板于正常培养基。ROCKi未改变TMZ耐药性。因此，添加ROCKi的DEP缓冲液改善细胞健康而不影响分选参数。

2.4 TMZ-resistant glioma cells can be sorted by electrophysiological properties

TMZ耐药细胞与对照在膜电容和中点膜频率上显著差异，表明可通过DEP分选富集高耐药细胞。为确定理想分选参数，建模了膜电容分别为10和20 mF/m²的两种假设细胞的行为（基于D54和D54-TR数据）。Clausius-Mossotti（CM）因子是细胞和周围介质电特性的函数，可预测细胞在特定电场频率下的DEP行为。CM因子图显示，在低频分散区，存在一频率使20 mF/m²细胞经历正DEP（CM因子>0），而10 mF/m²细胞为负DEP（CM因子<0）。建模表明可基于TMZ耐药性分选胶质瘤细胞。

使用两种分选装置：流体动力学斜角平行电极分选器（HOAPES）和改良HOAPES-3。HOAPES有三出口，产生两组分：从内通道收集的细胞（正DEP）为聚焦组分，从两外通道收集的细胞（负DEP）为非聚焦组分。若分选细胞大小相同，则分离主要由电生理特性（如膜电容）驱动；若大小不同，则分离可能与大小差异或大小与电生理特性组合相关。因此，需测量分选细胞的电生理特性和大小以确定主导因素。

新HOAPES-3装置具有改良延长电极阵列和5出口，产生三组分：出口1收集强正DEP细胞，出口2弱正DEP，出口3无净力或负DEP。HOAPES-3还包含细胞混合室防止细胞沉降。两种装置均基于单个细胞移动分选，由诱导DEP力和流体力组合驱动。

基于D54和D54-TR细胞膜电容重叠（D54范围14.2–27.5 mF/m²，D54-TR为5.1–19.8 mF/m²），假设D54群体中存在更低膜电容的更高耐药细胞。因此，测试DEP分选D54细胞是否能富集不同TMZ耐药群体。分选后收集组分，用3DEP测量电生理特性，并评估TMZ耐药性。通过培养等量细胞于递增TMZ浓度，测量存活细胞数，计算IC₅₀值评估耐药性。优化了D54 TMZ assay的多参数（细胞密度、每孔培养基体积、TMZ处理时间）。

HOAPES分选的D54细胞显示非聚焦和聚焦组分的电生理特性显著差异。非聚焦组分细胞膜电容值显著低于聚焦组分。非聚焦组分细胞中点膜频率值显著更高。膜电导或中点胞质频率无显著差异。非聚焦组分细胞TMZ耐药性显著更高。HOAPES-3分选D54细胞产生类似模式：最高膜电容细胞收集于出口1，更低膜电容和更高耐药细胞在出口3。

比较富集耐药细胞与长期TMZ培养耐药细胞，可识别直接关联耐药的特性而非化疗诱导的副产品。例如，分选D54细胞差异在耐药性，但细胞大小无差异。相反，长期TMZ培养的D54-TR细胞显著更大，表明细胞大小与TMZ培养相关。分选细胞有利，可提供耐药机制见解而避免长期TMZ暴露的混淆效应。

分选U251 GBM细胞以验证分选在不同细胞系中的可重复性。类似D54，U251非聚焦组分细胞膜电容更低、耐药性更高。HOAPES-3分选U251细胞，出口3细胞膜电容更低、耐药性更高。无膜电导和中点胞质频率明确趋势。分选U251细胞大小无差异，但U251-TR细胞更大，镜像D54模式。

总之，这些数据表明可通过DEP分选富集更高TMZ耐药细胞。胶质瘤细胞DEP分选有助于识别与耐药重要相关的特性，而非长期TMZ生长诱导。

2.5 TMZ-resistant cells enriched from oligodendroglioma/astrocytoma

因存在多种弥漫性胶质瘤，测试了除GBM外其他胶质瘤类型中差异耐药细胞的分选。使用一人胶质瘤细胞系，原描述为少突胶质细胞瘤，但基于新诊断标准现归类为恶性星形细胞瘤（IDH野生型，无1p/19q共缺失）。这些细胞在无血清条件下培养，称为HOG-A以反映原名（HOG）和更新分类（A恶性星形细胞瘤）。测试HOG-A细胞在DEP分选缓冲液中的存活率，发现添加ROCKi解决存活问题且不影响TMZ耐药性。优化TMZ assay确定3天TMZ孵育用于HOG-A细胞。

用HOAPES和HOAPES-3分选HOG-A细胞。如预期，HOG-A细胞显示频率依赖性DEP响应。HOAPES装置中，更高膜电容和更低中点膜频率的HOG-A细胞收集于聚焦组分，更低电容和更高中点膜频率在非聚焦组分。所有对照无膜电容或中点膜频率差异。无膜电导显著差异。

最高TMZ耐药HOG-A细胞富集于聚焦组分，表明TMZ耐药细胞可从其他胶质瘤类型富集。出乎意料，富集模式与GBM细胞相反（GBM中更高耐药细胞在非聚焦组分）。假设这可能与生长条件相关，因D54和U251 GBM细胞在血清中生长，而HOG-A细胞在无血清培养基中。为测试，将HOG-A细胞在含血清培养基中培养。4代血清培养后，HOG-A DEP谱移位，细胞膜电容降低、中点膜频率增加。分选血清培养的HOG-A细胞，更高TMZ耐药细胞收集于非聚焦组分，表明不同生长条件下DEP分选均可富集差异耐药细胞。如D54和U251 GBM细胞，分选HOG-A细胞差异在耐药性但大小无差异。

HOAPES-3分选HOG-A细胞显示膜电容值梯度，出口1细胞最高膜电容。出口1细胞中点膜频率最低，膜电导或中点胞质频率无差异。最高TMZ耐药细胞富集于出口1，细胞大小无差异。这些数据表明可从多胶质瘤类型DEP富集TMZ耐药细胞，且分选细胞大小无差异。

胶质瘤细胞高度动态，测试富集细胞的电生理特性和TMZ耐药是否在分选后维持。HOAPES-3分选D54细胞在分选后立即和3代后（约12天）显示相同膜电容和中点膜频率模式。类似，分选HOG-A细胞膜电容模式在分选后立即和2–3代后（15–20天）相同。分选细胞TMZ耐药模式在HOG-A分选后1和2代相同，并维持至4代（约25天）。结果表明胶质瘤细胞可基于TMZ耐药分选，且富集维持数代，为下游分析提供延长时限。

2.6 Separation of patient-derived GBM TMZ-resistant cells by electrophysiological properties

快速、无标记富集患者肿瘤中TMZ耐药细胞的方法可能开辟新发现和患者治疗途径。作为概念验证，测试DEP分选新从患者肿瘤衍生的GBM细胞是否产生TMZ耐药细胞。优化DB93患者衍生GBM细胞的TMZ assay，发现7天TMZ孵育给出最可靠IC₅₀值。细胞存活分析显示DB93 GBM细胞在DEP缓冲液中存活率更低，添加ROCKi未改善。因此测试DEP缓冲液补充CEPT（一种提高多细胞类型存活率的因子混合物）。添加CEPT cocktail改善DB93 GBM细胞在DEP缓冲液中的存活率且不改变TMZ耐药性，用于DEP分析和分选。

DB93 GBM细胞用HOAPES-3分选，分析聚焦于出口1和3细胞，因它们膜电容差异最大。分选DB93 GBM细胞差异在膜电容和中点膜频率，最高膜电容和最低中点膜频率细胞分离于出口1。所有对照无膜电容或中点膜频率差异。出口1和3细胞膜电导略有差异，但无明确模式。中点胞质频率无差异。TMZ耐药分析显示最高耐药DB93 GBM细胞收集于出口1，表明从新切除患者肿瘤GBM细胞中富集耐药细胞。有趣的是，富集模式与HOG-A细胞相似，可能因两者均在无血清条件下培养。分选DB93 GBM细胞直径略大于对照，但出口1和3细胞大小相似。

3 DISCUSSION

研究发现（a）TMZ耐药胶质瘤细胞可无标记仅基于细胞固有特性分离，（b）TMZ耐药与全细胞膜电容和细胞表面糖基化相关。这些发现可能引领患者肿瘤细胞的快速分离方法，实现个性化治疗的替代化疗药物测试和耐药机制详细分子表征。

分选富集TMZ耐药细胞较长期TMZ培养筛选有多优势。长期培养不准确模拟患者耐药细胞发展，因培养中TMZ暴露远长于患者治疗时间。此外，培养细胞可能不重现治疗前肿瘤内固有耐药细胞表型。数据表明长期TMZ培养的D54-TR和U251-TR细胞比未培养对照更大，可能解读为获得性耐药增大细胞大小。但分选细胞中无细胞大小与耐药关联，表明细胞大小非耐药良好指标。分选另一优势是速度；耐药细胞可快速富集，而培养衍生耗时数月。利用细胞固有特性富集临床重要TMZ耐药细胞是新方法，可提供现实时间框架用于分子表征和替代治疗测试，改善患者结局。

分选使用两种DEP微流体分选装置。HOAPES分选细胞为两组分，而改良HOAPES-3产生三组分。HOAPES-3优势在于可分选具有更广电生理特性或大小范围的细胞。对于大小无差异细胞，分选三组分还能更好分离最高（出口1）和最低（出口3）膜电容细胞，因中范围细胞导向出口2。这可提高分离保真度和下游细胞表型及基因表达模式分析。预期出口2细胞具中等TMZ耐药，但并非总是如此。这可能因每次实验导向出口2细胞百分比变异，或表明中等膜电容细胞生物学差异需进一步探索。未来需继续优化分选参数和增加装置出口以微调高TMZ耐药胶质瘤细胞富集。此外，结合机器学习算法与细胞分选的新技术可能提高分选保真度。例如，监督学习方法成功用于阻抗细胞术区分胰腺癌细胞和癌症相关成纤维细胞。阻抗细胞术类似DEP，检测细胞固有电生理特性。在HOAPES-3装置中纳入类似方法（表征单个细胞电生理特性并实施机器学习算法定制分选参数）可改进特定细胞靶向不同出口。

DEP检测的细胞固有特性已广泛用于识别和富集癌细胞，但少研究聚焦胶质瘤和化疗耐药细胞。U251 GBM培养通过非贴壁球体生长富集癌症干细胞，其DEP响应与单层细胞不同。这些数据可能与DEP检测TMZ耐药细胞一致，因癌症干细胞常更化疗耐药；但该研究未直接测量细胞电生理特性和TMZ耐药。另一研究发现五胶质瘤细胞系膜电容与p53和PTEN表达相关。对其他癌症类型，阻抗测量识别前列腺和乳腺癌细胞表型和药物处理响应。许多研究使用细胞单层阻抗测量，反映单个细胞特性以及细胞-细胞和细胞-ECM粘连。在高耐药循环肿瘤细胞模型中，活胰腺导管腺癌细胞与凋亡细胞用耦合DEP和确定性侧向位移（DLD）模块的微流体装置分离。因此，DEP分选可应用于多癌症类型富集化疗耐药细胞。

早期研究表明癌细胞化疗耐药与胞质电导相关。MCF7乳腺癌细胞培养于化疗药物中产生紫杉醇或阿霉素耐药细胞。耐药细胞与亲本MCF7差异在胞质电导，但模式依赖于化疗药物类型；紫杉醇耐药细胞胞质电导低于亲本MCF7，而阿霉素耐药细胞更高。结果可能更一致于相同化疗药物耐药细胞，因阿霉素耐药K562白血病细胞胞质电导高于亲本K562，匹配MCF7阿霉素耐药细胞模式。胞质电导与耐药关系确切性质不明，因用P-糖蛋白药物 efflux泵抑制剂处理阿霉素耐药K562细胞降低其阿霉素耐药至亲本水平但不改变胞质电导。未观察差异TMZ耐药胶质瘤细胞胞质电导差异，表明可能不同癌症类型耐药机制差异。

发现DEP分选胶质瘤细胞膜电容和中点膜频率显著差异，这些差异也在长期TMZ培养衍生耐药细胞中观察到。 Notably，膜电生理特性与TMZ耐药跟踪并允许从多胶质瘤类型富集耐药细胞。基于电生理特性分选细胞可能有效靶向其他肿瘤类型化疗耐药细胞，因膜电容区分多能干细胞系命运且耐药细胞常作为癌症干细胞驱动新肿瘤生长。因此，细胞固有特性提供胶质瘤化疗耐药稳健测量，需进一步探索。

DEP检测的膜电容反映质膜组成和拓扑结构，并对细胞表面糖基化敏感。既往发现N-连接糖基化，特别是N-糖链分支通路，调控神经干细胞膜电容和命运偏向。此处凝集素结合识别对照和TMZ耐药胶质瘤细胞N-糖链差异。与对照相比，耐药细胞E-PHA凝集素（检测平分型N-糖链）和DSL凝集素（结合β1–4分支N-糖链）结合降低。N-糖链分支通路是癌细胞功能关键调节因子，控制多种可能贡献耐药的细胞表面蛋白，如黏附蛋白、生长因子受体、膜转运蛋白和离子通道。但分支通路在化疗耐药中作用未深入studied。还发现对照和耐药细胞岩藻糖基化模式差异。耐药细胞外侧岩藻糖（AAL凝集素检测）水平更低。含岩藻糖N-糖链有助于识别癌细胞和判断预后，但需更多研究评估岩藻糖基化在化疗耐药中作用。总之，N-糖基化是胶质瘤细胞重要调节因子，需进一步研究。

糖基化可通过促进脂筏形成（胆固醇富集信号中心）和调节表面黏附分子活性（连接胞外基质与内部细胞骨架）调控细胞刚度。癌症中细胞和基质刚度改变，创造肿瘤细胞与微环境力学复杂 interplay。测量细胞刚度和可变形性以及阻抗的微装置可区分胰腺癌细胞与肿瘤相关成纤维细胞，表明评估肿瘤细胞物理特性重要性。糖基化、膜电容和化疗耐药差异的胶质瘤细胞可能具额外生物物理特性（如刚度），可用于从患者肿瘤富集。

总之，差异TMZ耐药的胶质瘤细胞可基于独特质膜特性在无标记系统中分选。差异耐药细胞还变异在糖基化，其调控与耐药机制 tied 的质膜蛋白。未来需进一步评估患者肿瘤TMZ耐药细胞质膜特性。

4 METHODS

4.1 Ethics statement

本研究获加州大学尔湾分校（UCI）机构审查委员会批准（HS# 2012-8912）。DB93细胞从UCI医疗中心切除患者肿瘤多余手术组织分离，遵循机构指南，先前书面知情同意并严格遵守法律和机构伦理法规。本手稿制备未使用人工智能大语言模型。

4.2 Glioma cell culture

D54-MG（GBM）、U251-MG（GBM）和替莫唑胺（TMZ）耐药细胞D54-TR、U251-TR作为贴壁培养在含血清培养基中生长，而HOG-A细胞作为非贴壁球体在无血清培养基与FGF和EGF中生长。部分实验中，HOG-A细胞在血清中作为贴壁培养（HOG-A-S）3–6周后分析。DB93患者衍生细胞作为贴壁培养在层粘连蛋白上无血清培养基与FGF和EGF中生长。短串联重复测试（Labcorp）确认D54（也称A-172）、D54-TR、U251、U251-TR、HOG-A细胞和DB93患者细胞身份，不匹配任何细胞系。所有细胞常规筛查支原体确保无污染。

4.3 DEP analysis and buffers

DEP实验缓冲液如既往所述用于人和鼠细胞。RHO/ROCK通路抑制剂（ROCKi）Y-27632以1至10 μM浓度加入DEP缓冲液。DB93患者衍生GBM细胞的DEP缓冲液补充1× CEPT cocktail（缓冲液中最终浓度：50 nM chroman 1, 5 μM emricasan, 1× polyamine supplement, 0.7 μM trans-ISRIB）替代ROCKi。细胞对DEP电场响应（DEP谱）和电生理特性（膜电容、膜电导、中点膜频率、中点胞质频率）用3DEP分析仪测量。部分情况下，中点胞质频率无法准确获取，因应用频率范围未产生足够 magnitude DEP谱在高频范围下降以给出可靠值，故未报告。

4.4 Flow cytometry, cell viability and TMZ resistance assays

凝集素结合通过固定单细胞流式细胞术评估，使用所述凝集素。细胞在DEP缓冲液孵育后立即通过台盼蓝染色评估存活率，恢复2天后通过XTT assay评估。为测量TMZ耐药，细胞用TMZ浓度范围处理，测量存活细胞（XTT assay），IC₅₀值在GraphPad Prism中计算，使用非线性回归分析， specifically log(inhibitor) versus normalized response方程和可变斜率模型。

4.5 Modeling and simulations in MyDEP

D54和D54-TR测量特性（膜电容和电导、胞质电导率和介电常数）用于在MyDEP中单层壳模型模拟DEP谱；值提供。

4.6 Glioma cell sorting with the hydrodynamic oblique angle