PRPF31相关视网膜营养不良的表型特征：一项自然史研究基线数据的临床见解

　　本文前瞻性评估了PRPF31相关视网膜营养不良（RD）的多中心队列，通过多模态结构（SD-OCT、UWF-FAF）与功能（BCVA、FST、MP）检测，揭示了疾病的高度变异性，发现HAR面积与FST、scotopic MP强相关，为临床试验提供了关键终点指标。

　　

1 引言

视网膜色素变性（RP）是最常见的遗传性视网膜营养不良，是工作年龄人群不可逆盲的主要原因之一。常染色体显性RP（adRP）占RP病例的约30%–40%，而PRPF31基因变异是adRP的第二常见遗传原因，占2.5%–12%。PRPF31相关视网膜营养不良（PRPF31-RD）具有高度的临床和遗传异质性，其典型的疾病过程包括儿童期夜盲症发作，三十岁前出现进行性周边视野丧失和中心视力下降。然而，其表型表达性差异很大，即使在具有相同变异的个体中也是如此，并且在受累家庭中经常报告有不外显的携带者。这种变异性可能受到等位基因异质性和遗传修饰因素的影响。尽管PRPF31-RD目前无法治愈，但基因疗法的有希望的发展凸显了对介入性临床试验可靠且可行的结果测量的需求。在这种情况下，自然史研究对于识别治疗反应的预测因子和定义资格标准至关重要。鉴于RP功能测试的复杂性，需要采用多模态方法来评估长期进展。

2 材料与方法

2.1 研究设计与参与者

31名PRPF31-RD成年患者被纳入一项前瞻性、观察性自然史研究，研究在三个中心进行：奥斯陆大学医院（挪威）、ASST Santi Paolo e Carlo医院（意大利米兰）和隆德大学医院（瑞典）。纳入标准包括：经全视野视网膜电图证实的RP临床诊断、PRPF31基因的杂合致病性或可能致病性变异、年龄≥18岁。临床数据包括自我报告的症状发作、性别、年龄、医疗和家族史以及当前用药。疾病持续时间从患者报告的症状发作年龄算起。在奥斯陆大学医院（挪威/瑞典队列）和ASST Santi Paolo e Carlo（意大利队列）进行了完整的眼科检查，包括裂隙灯生物显微镜检查、眼底镜检查以及多模态结构和功能视网膜评估。研究遵循《赫尔辛基宣言》，并获得相关伦理委员会和数据保护服务的批准。所有参与者均提供了书面知情同意书。

2.2 遗传测试

遗传测试在研究纳入前由认证实验室使用全外显子组或全基因组测序以及针对遗传性视网膜疾病的panel进行。根据美国医学遗传学与基因组学学院（ACMG）指南，将变异致病性评估为致病性或可能致病性。

3 表型特征

3.1 结构评估

使用海德堡Spectralis系统（Heidelberg Engineering，德国）进行光谱域光学相干断层扫描（SD-OCT）。获取高分辨率黄斑体积扫描（30°?×?25°）和水平线扫描（30°，16帧平均）。记录了囊样黄斑水肿（CMO）、视网膜前膜（ERM）和玻璃体黄斑牵引（VMT）的存在。椭圆体带（EZ）被分类为保留、中断或无法检测。在穿过中心凹的水平扫描中，EZ宽度由两名独立评分者（KOE, JPH）使用海德堡Eye Explorer（HEYEX）软件手动测量鼻侧和颞侧边界：使用平均值，分歧通过共识解决。

使用Optos? California系统（Optos plc，苏格兰，英国）进行超广域眼底自发荧光（UWF-FAF）成像，利用532 nm的绿色波长。视网膜表型被分类为经典RP（血管衰减、周边低自发荧光、后极部高自发荧光）或中心周（血管保留和周边保留的自发荧光伴中周部丧失）。记录了高自发荧光环（HAR）的存在和完整性，并使用设备的内置标尺由两名独立评分者测量内部HAR面积。

3.2 功能评估

使用ETDRS图表单眼测量最佳矫正视力（BCVA）。使用中性密度滤光片评估低亮度视力（LLVA）。通过从BCVA中减去LLVA来计算低亮度缺损（LLD）。

使用黄斑完整性评估（MAIA）设备（CenterVue，意大利）在瞳孔散大后进行明视微视野计（MP），使用68点10-2网格和4-2阈值策略。在使用505 nm青色刺激的暗视MP在暗适应30分钟后进行，使用37点网格。记录了平均灵敏度（MS）、固视丢失（%）和双变量轮廓椭圆面积（BCEA95, deg²）。排除了固视丢失>25%或BCEA95 >23.1 deg²的测试。

使用Espion E3系统（Diagnosys LLC，美国）在瞳孔散大和暗适应30分钟后进行红、白、蓝刺激的全视野刺激阈值（FST）测试。使用双参数Weibull函数确定刺激阈值。结果记录在-75至+30 dB的动态范围内（基线0.01 cd/m²；10 dB = 1对数单位）。使用了“看见/未看见”反应策略。仅纳入符合制造商质量等级2-3的测试。如果去除异常值能使质量提高且不改变平均灵敏度>1.7 dB，则允许去除异常值。使用蓝-红阈值差异来推断主要负责光介导的光感受器，基于预定义标准：>19.3 dB = 视杆细胞介导；<3.6 dB = 视锥细胞介导；3.6–19.3 dB = 混合介导。

3.3 统计分析

通过直方图、箱线图和Shapiro-Wilk检验评估数据分布。正态分布结果以均值±标准差（SD）表示；非正态分布数据以中位数（范围）报告。使用Spearman等级相关（r_s）分析选定的临床参数、疾病持续时间和年龄之间的关联，最初显著性设定为p < 0.05。应用Bonferroni校正进行多重比较后，调整后的p值变为p < 0.008。使用Bland-Altman图和组内相关系数（ICCs）评估眼间和评分者间的一致性。由于眼间对称性高，统计分析中仅包括右眼数据。

4 结果

4.1 患者人口统计学、遗传学和疾病发作

队列包括31名PRPF31-RD患者：10名来自挪威，13名来自瑞典，8名来自意大利，代表21个无关家庭。他们的 demographic 和遗传学发现总结在表1中。确定了17种独特的致病变异，其中4种变异在多于一个家庭中观察到。没有变异在国家间共享。十二种（71%）变异被分类为致病性，五种（29%）为可能致病性。缺失变异是最常见的；13名患者（42%）表现出六种不同的缺失变异，其中三种是全基因缺失。其余变异包括七种提前终止密码子变异（9名患者，29%）、三种剪接变异（7名患者，23%）和一种错义变异（2名患者，6%）。四种变异是先前未发表的。队列遗传变异在PRPF31基因中的分布示意图呈现（图1）。

队列包括20名女性（65%）和11名男性（35%），中位年龄为38岁（范围19-84）。最常报告的最初症状是夜盲症（84%），其次是周边视野丧失（10%）和两者兼有（7%）。自我报告的症状发作中位年龄为10岁（范围0-35）；68%报告发作年龄≤13岁，10%报告发作年龄>30岁。中位疾病持续时间为30年（范围4-77）。三十名患者（97%）表现出双侧、早至晚期经典RP，而一名表现为早期中心周RP。

4.2 临床特征和多模态检查结果

中位BCVA为74.5 ETDRS字母（范围14-88），排除一名无法阅读图表的患者。队列水平的总结数据呈现在表2中，个体数据在表S1中按年龄排序以说明表型变异性。十五名患者（48%）达到ETDRS字母评分>75（LogMAR等效值0.2），12名患者（39%）为50至75，其余4名患者（13%）<50（LogMAR等效值0.7）。低亮度视力（LLVA）在27名患者（87%）中可评估，中位数为66 ETDRS字母评分（范围2-79），产生中位低亮度缺损（LLD）为9个字母（范围1-61）。

十三名患者（42%；年龄36-84岁）曾接受过白内障手术，而7名（23%；年龄20-65岁）表现出后囊下白内障（PSC）。两名患者（7%；年龄34和57岁）患有早期混合性白内障，九名（29%；年龄19-36岁）晶状体清晰。一名患者表现出周边视网膜中继发的Coats样血管异常。

UWF-FAF成像可用于23名患者（挪威/瑞典队列）。高自发荧光黄斑环（HAR）存在于15名患者（65%；年龄19-58岁），在七名（30%）中缺失，在一名中心周RP病例中无法分类。内部HAR面积可在12名患者（52%）中测量，中位面积为2.2 mm²（范围0.9-12.1）；三例因视网膜萎缩或晶状体混浊导致环形态中断而被排除。

在所有参与者中进行了SD-OCT。囊样黄斑水肿（CMO）存在于16名患者（52%；年龄21-65岁），其中两名（7%）患者为单侧。视网膜前膜（ERM）见于17名（55%；年龄19-80岁）患者，玻璃体黄斑牵引（VMT）见于4名（13%；年龄20-84岁）患者。椭圆体带（EZ）波段在21名患者（68%）中保留并可测量，在两名患者中中断，在一名中心周RP患者中因边界超出扫描长度而无法测量（图2），在七名（23%）患者中无法检测到。在可测量组中，EZ宽度中位数为1492 μm（范围512-4362）。EZ和HAR缺失的最年轻患者为48岁，而保留EZ的最年长患者（63岁）有一个微弱、无法测量的HAR。

明视微视野计（MP）测试在24名患者（77%）中完成。平均灵敏度（MS）为9.0 dB（SD ± 5.9）。三名患者（10%）未能完成测试，一名超过固视丢失阈值（>25%），三名患者（10%）的BCEA95 >23.1 deg²。BCEA95中位数为1.3 deg²（范围0.1-20.8）；65%表现出零固视丢失。

暗视青色MP在23名患者（挪威/瑞典队列）中尝试，在13名（57%）中获得可靠结果。九名患者（29%）无法完成测试，一名显示不稳定的固视（BCEA95 57.1 deg²）。在可测量结果的患者中，MS中位数为1.2 dB（范围0-13.4），BCEA95中位数为1.8 deg²（范围0.3-6.0）。所有具有可测量暗视MP结果的患者都保留了HAR和EZ。三名暗视灵敏度为零dB的患者具有最短的EZ宽度，均<1400 μm。

在31名患者中，红刺激的可靠FST测试在27名患者（87%）中实现，蓝刺激在26名患者（84%）中实现，白刺激在28名患者（90%）中实现。平均（±SD）灵敏度为-19.3（± 12.0）dB（红），-26.8（± 17.2）dB（蓝）和 -23.5（± 16.7）dB（白）。蓝红差异中位数为-4.8 dB（范围 -26.6 至 -6.2）。在25名患者中评估的光感受器介导表明，五名患者（16%）以视杆细胞介导为主，12名患者（39%）主要以视锥细胞介导，八名患者（26%）为混合介导。

经典和中心周表型模式的早期病例之间的差异在图2中展示。中心周病例的眼底照片显示保留的视网膜血管和少量骨细胞样色素；UWF-FAF图像显示病理主要位于鼻侧黄斑和视盘周围；OCT图像显示颞侧EZ波段超出扫描图像。在两种情况下，MP显示视网膜灵敏度下降主要位于黄斑的鼻侧部分。

4.3 疾病对称性和检查者间变异性

BCVA（29名患者）和明视MP MS（24名患者）的Bland-Altman分析证实了强的眼间一致性，具有高的组内相关系数（ICC）= 0.99（BCVA，95% CI: 0.97–0.99）和ICC = 0.97（MP，95% CI: 0.93–0.98），两者p < 0.001（图S1）。平均眼间差异分别为1.3 ± 3.8字母和0.88 ± 1.87 dB。检查者间变异性有利地较低。EZ宽度测量显示平均（± SD）检查者间差异为31.6（± 83.8）μm，HAR面积测量显示差异为0.12（0–0.3）mm²。相应的ICC对于EZ为0.998（95% CI: 0.995–0.999），对于HAR为0.995（95% CI: 0.981–0.998）（两者p < 0.001）。

4.4 结构-功能相关性

BCVA与基线年龄之间没有显著相关性（r_s = -0.2, p = 0.21），与任何其他指标也没有显著相关性，除了LLVA（表S2）。所有FST刺激都显示出显著的相关性（表S3），特别是在白和蓝刺激之间（r_s = 0.98, p < 0.001）。Spearman相关分析证实了选定的结构和功能参数之间的几个强关联：明视和暗视MP、FST白、HAR面积、EZ宽度和疾病持续时间（表3）。

HAR面积与明视MP和FST白显著相关（r_s = 0.79 和 0.81；p = 0.006 和 p = 0.005）。FST白也与暗视MP相关（r_s = 0.81, p = 0.001），并且FST白和明视MP（图3a–b）都与疾病持续时间显著相关（r_s = 0.72 和 0.67；两者p < 0.001）。EZ宽度与HAR面积强相关（r_s = 0.98, p < 0.001），并且这两个测量也与暗视MP强相关（r_s = 0.96 和 0.95；p < 0.001）（图4a–c）。所有报告的相关性在Bonferroni校正后仍然显著。

5 讨论

本研究评估了欧洲多中心前瞻性PRPF31-RD自然史研究参与者的基线临床特征，这是首次应用全面的多模态结构和功能视网膜评估的研究。我们通过报告四种新变异和一例中心周RP模式扩展了基因型和表型谱。我们还评估了跨疾病阶段的几种候选结果测量的可行性和性能，包括EZ宽度、HAR面积、FST和MP在PRPF31-RD患者组中的应用。

在我们队列中鉴定的遗传变异反映了PRPF31-RD的异质性。虽然已发表的PRPF31致病变异遍布整个基因，但研究表明其聚集在外显子6-10，特别是外显子7和8。然而，最近的一项大型研究不支持这一点，我们在队列中也没有在外显子7或8发现任何变异（图1）。正如预期的那样，我们主要观察到推定的功能丧失变异，与单倍体不足作为疾病机制一致，不包括错义和剪接变异，这些需要进一步的致病性功能研究。PRPF31中的错义变异很少报道，其功能影响尚未得到充分评估。在我们的队列中，错义变异与中心周RP模式相关，而不同的PRPF31错义变异则与锥杆细胞营养不良相关。

在临床上，夜盲症不足为奇是最常见的首发症状，通常在儿童期或青少年早期发作。尽管总体疾病发作较早，但成年队列在基线时的视力相对保持较好。队列中的眼内对称性很高，说明了一致的双侧疾病进展以及在多模态环境下双眼测试完成的可靠性，而没有因疲劳影响结果。我们发现队列中LLD ETDRS字母评分变异性很高，主要是由于两端存在极端异常值。尽管LLVA先前曾被提议作为RP进展的敏感早期指标，LLD缺损>13个字母表明视网膜功能障碍，但这比我们队列的中位值高四个字母。我们研究中可变的LLVA评分也可能反映了CMO、PSC的存在、缺乏标准化的暗适应和/或患者对测试程序不熟悉。然而，这些发现值得进一步评估LLVA在PRPF31-RD中的测试-重测可靠性。

白内障在各年龄组都很常见，在年仅20岁的患者中就观察到PSC。超过50%的患者表现出CMO（年龄23-65岁）和/或ERM（年龄19-80岁），这与先前的报告一致，表明CMO主要在年轻的PRPF31-RP年龄组中观察到，而ERM在老年个体中观察到。未观察到CMO与女性性别之间的关联，这与最近的一项研究不同。40岁以后EZ带的保留被认为是不寻常的，然而我们研究中六名年龄在42-63岁的患者保留了可测量的EZ，这与最近的发现一致。这些结果强化了年龄匹配个体间疾病表达的已知变异性。

结构和功能测试的可行性因疾病阶段而异。尽管SD-OCT和UWF-FAF容易获得，但HAR面积和EZ宽度只能在约50%–70%的参与者中测量。然而，手动测量显示出高的检查者间一致性，支持它们作为进展标志物的使用。在功能测试中，FST显示出最高的完成率，并与几个其他指标强相关，表明其在疾病严重程度范围内的稳健性，与先前的报告一致。明视MP由77%的患者完成，复制了先前报告的高可行性。暗视MP是一种有前途的早期视杆细胞功能障碍模式，在遗传性视网膜疾病中很少报道。挪威/瑞典队列中约60%的患者设法完成了测试，任何完成测试的参与者的最低视力为60 ETDRS字母评分。有趣的是，我们发现只有在保留EZ带和HAR的患者中才能进行暗视青色MP，表明这些视网膜特征是完成测试的先决条件。

我们的研究中未观察到BCVA与年龄之间的显著相关性，与先前的发现相反，也与其他指标无关，除了LLVA。这凸显了视力作为PRPF31-RD功能下降替代指标的局限性。然而，在替代测量之间观察到了几个强相关性。FST刺激高度相互关联，特别是白和蓝（r_s = 0.98, p < 0.001），这种模式在USH2A相关RD中也注意到，通常归因于视杆细胞介导。在我们的队列中，这些相关性仍然很强，尽管大多数患者表现出视锥细胞或混合光感受器介导。因此，我们仅选择白刺激进行进一步分析，并发现与结构HAR面积强相关，尽管与先前报道的EZ宽度无关。FST白也与暗视青色MP强相关（r_s = 0.81, p < 0.001），可能反映了共享的视杆细胞介导功能。疾病持续时间与FST白和明视MP相关，与USH2A相关RD患者的发现一致。然而，必须谨慎对待疾病持续时间，因为自我报告发作的不准确性，特别是在儿童期。暗视MP与HAR面积和EZ宽度都相关，突出了它们在估计视杆细胞介导功能中的相互关联作用。然而，观察到了地板效应：所有三名EZ宽度<1400 μm的患者记录了0 dB平均灵敏度，表明存在一个结构阈值，低于该阈值时，暗视MP中的MS作为参数不再提供信息。HAR面积与暗视MP和FST白之间的强相关性支持使用自发荧光成像作为PRPF31-RD功能阶段的指标，如果功能测试不可行。

我们队列中的单个病例表现为中心周RP，一种罕见且异质性的RP亚型。这名36岁女性表现出晚发性夜盲症，晶状体清晰，无CMO或ERM，并且BCVA极佳。尽管保留了高的明视MP灵敏度，但她的暗视MP显著降低，与鼻侧黄斑选择性视杆细胞功能障碍一致。FST结果对于蓝和白刺激很强，但对于红刺激处于中等范围，可能反映了不对称的视锥细胞受累。她的错义变异c.910C>T p.Arg304Cys先前未与此表型相关，尽管已发表过类似的成像特征。有趣的是，相同的变异在一名无关的80岁男性中被鉴定出，他有晚发性和终末期疾病，尽管他的表型无法回顾性评估。我们队列中的中心周RP病例突出了PRPF31-RD的表型多样性。

本研究的一个关键优势是其前瞻性设计，并在多个欧洲中心采用统一方案，能够标准化获取多模态数据。EZ和HAR的测量在单一中心由两名独立检查者进行，最大限度地减少了变异性。局限性包括排除儿科患者、疾病晚期患者数据完整性降低，以及HAR和暗视青色MP测量仅适用于挪威/瑞典队列。尽管是迄今为止最大的PRPF31-RD队列之一，样本量仍然限制了某些统计分析。

总之，本研究提供了迄今为止最大前瞻性队列中PRPF31-RD的深入表型特征。我们证明了年龄匹配个体间临床表达的变异性，并描述了BCVA、LLVA、EZ宽度、HAR面积、FST、明视微视野计和暗视微视野计作为候选结果测量的效用和局限性。FST成为跨疾病阶段最稳健的功能指标。暗视MP显示出前景，但仅限于保留EZ和HAR的患者，表明在选择试验终点时需要特定阶段的分层。虽然本研究侧重于基线发现，但纵向设计将能够未来评估检查的测试-重测变异性和随时间推移的疾病进展率，这对于验证这些测量作为PRPF31-RD临床试验终点至关重要。