移植患者HSV、VZV与EBV病毒检测：内建多重实时PCR法与Altona Diagnostics试剂盒的性能对比研究

　　本研究开发并验证了一种内建多重实时PCR（multiplex real-time PCR）方法，用于同步检测移植患者中的HSV、VZV和EBV病毒。该方法展现出100%灵敏度及95%以上特异性，检测限（LOD）低至6.25–25 copies/mL，且无交叉反应，为临床提供快速、精准、低成本的病毒筛查方案。

　　

引言

疱疹病毒家族中的单纯疱疹病毒（HSV）、水痘-带状疱疹病毒（VZV）和爱泼斯坦-巴尔病毒（EBV）在移植患者中引发严重临床挑战。由于免疫抑制状态，这些患者极易发生机会性感染，并可迅速发展为危及生命的并发症。传统检测方法如病毒培养和血清学检测灵敏度低、耗时长，而实时PCR已成为病毒检测的金标准。多重实时PCR技术可同时检测多种病原体，显著提升诊断效率并降低成本。本研究旨在设计一种内建多重实时PCR方法，用于同步检测HSV、VZV和EBV，并与Altona Diagnostics的RealStar PCR试剂盒进行性能比较。

材料与方法

临床样本

研究共纳入270例移植患者的血浆样本，采集时间为2024年4月至9月。样本包括HSV阳性50例、阴性40例，VZV和EBV各阳性20例、阴性70例。所有样本使用Altona RealStar PCR试剂盒进行初筛，并以此结果为金标准。同时检测人RNaseP基因以监控提取效率及PCR抑制情况。

病毒DNA提取

使用QIAamp DNA Mini Kit从200 μL血浆中提取病毒DNA，最终洗脱体积为60 μL。每批提取均设阳性与阴性对照，并加入人RNaseP作为内参。

引物与探针设计

使用AlleleID7和Primer-BLAST软件，针对HSV、VZV和EBV的保守区域设计特异性引物和探针。同时设计人RNaseP内参系统。所有序列均通过BLAST验证特异性，具体序列见表1。

多重实时PCR优化

反应在ABI StepOne系统上进行，体系包括QuantiTect Probe PCR Master Mix、引物、探针和模板DNA。循环条件为：95°C 15分钟，随后40个循环的95°C 10秒和60°C 30秒。

性能评估与统计

以内建方法检测样本，以Altona试剂盒结果为标准计算灵敏度、特异性。进行交叉反应测试，使用包括CMV、HHV-6、HHV-7、HHV-8及细菌DNA验证特异性。通过质粒标准品稀释系列确定检测限（LOD）。使用Bland–Altman分析和线性回归评估两种方法的一致性。

结果

检测性能

内建方法对HSV、VZV和EBV的灵敏度均为100%，特异性分别为98%、97%和95%。未观察到与其他病毒或细菌DNA的交叉反应。

检测限与精度

内建方法的LOD分别为HSV: 6.25 copies/mL，VZV: 25 copies/mL，EBV: 25 copies/mL，低于Altona试剂盒的50 copies/mL。批内与批间精密度显示CV值均低于4%，表明方法稳定性高。

一致性分析

Bland–Altman分析显示，HSV、VZV和EBV的平均差异分别为1.35、-3.29和1.75，绝大多数数据点落在95%一致性界限内。线性回归得出R2值分别为0.82、0.93和0.94，显示两种方法高度相关。

讨论

本研究建立的内建多重实时PCR方法在灵敏度、特异性和检测限方面均表现优异，尤其适用于低病毒载量样本的检测。其低成本、高效率的特点使其特别适合资源有限的临床环境。未来可进一步扩大样本量并扩展至其他疱疹病毒（如CMV）的检测。

结论

该内建方法是一种可靠、高效的诊断工具，可用于移植患者中HSV、VZV和EB病毒的同步检测，有助于临床及时干预和治疗决策。

伦理声明

本研究经伊朗生物医学伦理委员会批准（批准号：IR.IAU.KAU.REC.1403.006）。

利益冲突

作者声明无利益冲突。

作者贡献

Reyhaneh Kalhor：执行实验、数据收集、初稿撰写；Mahdi Paryan：监督、方法设计、审稿与编辑；Sirous Naeimi：监督与方法设计；Hourieh Kalhor：概念设计；Hassan Noorbazargan：数据整理；Samira Mohammadi-Yeganeh：验证与审稿。

致谢

感谢伊朗巴斯德研究所提供的技术支持。