利福霉素C-3延伸结构对抗分枝杆菌活性的新构效关系洞察及其在结核病药物发现中的意义

　　本文系统探讨了利福霉素C-3延伸结构修饰对抗结核（MTb）活性的影响，通过构效关系（SAR）研究揭示了刚性脂环族腙类衍生物具有优越的抗菌活性，并发现logP与生物活性存在显著相关性，为优化利福霉素类结核病（TB）药物的理化性质及靶点 engagement 提供了关键结构线索。

　　

引言

利福霉素衍生物如利福平（1）数十年来一直是结核病（TB）治疗的核心药物。其独特的灭菌活性促使研究人员持续探索该药效团的新衍生物。通过结构活性关系（SAR）研究，目前已批准利福喷丁（2）和利福布汀（3）等半合成衍生物，这些化合物在C3和C4位的结构修饰在保持抗微生物活性的同时改善了药代动力学特性。

利福霉素通过结合细菌RNA聚合酶（RNAP）的DNA/RNA通道发挥抗菌作用，该结合位点远离RNAP催化位点，也不同于非达霉素的结合位点。利福霉素共享一个聚酮衍生的安莎桥链，连接萘醌或氢化萘醌核心。对核心支架的修饰通常会对生物活性产生负面影响，特别是在C-8、C-21和C-23位的三个羟基，这些位点与RNAP结合位点中的氨基酸残基形成关键氢键。

成功的修饰发生在C-11和C-25位，最近Peek等人报道了天然利福霉素同系物kanglemycins（如Kang V1，4）的发现，这些化合物在C-20和C-27位被修饰。虽然kanglemycins对野生型MTb的活性比利福平低2-25倍，但其不寻常的支架添加促进了与RNAP的额外静电相互作用，改善了对利福平耐药MTb的活性。

X射线共晶数据显示，C-3/C-4延伸朝向RNAP活性位点的开放口袋，不直接与结合位点氨基酸产生静电相互作用。尽管如此，大多数针对C-3和C-4区域的合成延伸研究都成功提高了抗菌性能。此外，对利福霉素C-3延伸的酶修饰已成为诺卡氏菌的次要耐药因子。早期的研究表明，C-3/C-4位的取代模式以及连接到核心的取代基性质（中性或碱性）在观察到的抗菌活性谱中扮演重要角色。

结果与讨论

化合物5-30针对药物敏感的H37RvMA Mtb菌株进行了改良的微孔板Alamar blue assay（MABA）评估。研究了三种不同的Middlebrook 7H9生长培养基对化合物活性的影响，这些培养基分别含有Tween 80（7H9ADCGLUTW）或被Tyloxapol替代（7H9ADCGLUTX或7H9CASGLUTX）。

整个库在三种培养基中均显示出良好的抗分枝杆菌活性，MIC₉₀值均低于3μM，并且普遍优于异烟肼（Inh）和莫西沙星（Mox），与利福平（Rif）活性相当。几种化合物的MIC₉₀活性低于实验截止值0.01μM。不同生长培养基之间的生物活性变化高达两个数量级。

在7H9ADCGLUTW中进行的测定显示，大多数化合物超过了"值得注意"的活性阈值，只有少数例外，包括化合物8、22和30。在没有Tween 80的情况下进行的MIC₉₀测定显示出更多样化的活性景观，包括利福平的活性相对降低。活性变化在化合物6、7、10、11、13、17、18和19中特别明显，当在无Tween 80培养基中测定时，它们的MTb抑制活性下降了至少一个数量级。

除化合物5和16外，没有一种脂肪胺类似物（5-21）显示pMIC₉₀值大于7。通常，在C3取代基上具有更灵活仲胺的化合物（如6-9）比那些具有环约束叔胺的化合物（如作为哌嗪的13-16或作为哌啶的20、21）活性稍差。在无Tween 80培养基中，用杂芳香吡啶（15）或嘧啶（16）取代的哌嗪的存在似乎有利于活性，而较大的苄基取代基（17和19）对活性有负面影响。

化合物12是利福平的氨基类似物，其相对中等活性表明胺和伴随的可旋转C-N键代表了抗分枝杆菌活性的活性悬崖。这一结果与早期研究一致，其中化合物12在其他革兰氏阳性菌株测试中的活性明显低于利福平。这种结构修饰导致了12和1分子内氢键的方向、极性和强度差异，影响了安莎桥相对于萘核的排列以及C-3延伸的构象，从而共同影响RNAP结合。

化合物23-26和利福平具有环状叔腙，在所有三种生长培养基中显示出显著的抗分枝杆菌活性。虽然苯腙化合物（28）在所有三种培养基中显示出一些令人鼓舞的活性，但通常，仲腙（22、27、29和30）的存在导致生物活性显著降低，这也是氨基利福霉素中观察到的趋势。

含氮杂环己烷的化合物25是唯一在所有三种培养基中超过实验阈值的化合物，显示出总体上优于利福平的活性，被认为是该库中最有效的化合物，而稍小的哌啶（24）和吗啉（26）类似物也令人鼓舞。

亲脂性通常被认为是复杂分枝杆菌细胞壁被动扩散的重要参数，也是许多潜在抗分枝杆菌药物生物性能差的一个共谋因素。细胞渗透性的变化通常是解释分枝杆菌生物学数据时的一个混淆因素。在Tween 80培养基中获得的数据显示 generally higher activity，而在无Tween培养基中观察到更多样化的SAR。

绘制pMIC₉₀与实验测定的logP的关系图显示两个参数之间存在一般相关性。这可能是由于改善了细胞渗透性，并部分解释了化合物23-26显示的强效活性。然而，更有信息量的是那些活性和logP值不相关的化合物，这些化合物指向可能增强（1）或破坏（18、19、22和29）靶点结合的C-3延伸。

基于这些数据，我们选择了一小部分化合物用于评估对利福平和非达霉素耐药Mtb的活性。虽然对非达霉素耐药菌株保持了生物活性，但这并未扩展到具有S447L RNAP突变体的利福平耐药菌株，在那里观察到显著的活性转变，表明这些C-3修饰无法克服S447L突变。这一结果是可以理解的，因为野生型S447与萘核发生关键相互作用。

结论

本文报道了一系列先前合成的疏水性利福霉素同系物的生物学评估，用于它们的Mtb抑制活性。几种化合物对药物敏感的MTb显示出强效的生物活性。获得了几个重要的见解，包括当C-3延伸包含连接到叔脂环胺的刚性腙功能时，活性最大程度地增强。

此外，我们发现生物活性和亲脂性之间存在强相关性，尽管几种化合物没有遵循这一趋势，表明这些C-3延伸除了调节理化性质的能力外，对活性有害。除化合物5和16外，具有柔性含胺C-3延伸的化合物通常活性较差，而脂肪链（8）非环状（22）或大的苄基N-取代基（17、19、29）的存在对活性有负面影响。

计算机计算表明，这种现象至少部分是由于两性离子诱导的安莎桥构象改变。相比之下，其C-3延伸包含更刚性的脂环叔腙的化合物显示出强效的抗分枝杆菌活性。特别是化合物23-26，是强效的抗分枝杆菌剂，在无Tween 80培养基中的活性优于利福平。

虽然对非达霉素耐药菌株保持了活性，但并未扩展到利福平耐药菌株。鉴于利福霉素作为一线Mtb化疗药物的重要性，如本研究所证明的利福霉素SAR的扩展理解在持续对抗Mtb的斗争中很重要。然而，本研究的结果也表明，单独修饰C-3/C-4延伸可能不足以克服Mtb耐药的挑战。

因此，开发临床相关的利福霉素类似物需要多方面的 approach。这可能包括结合Mtb分子伴侣抑制的最新进展，这部分减轻了利福平突变。此外，化合物5、16、23-26中存在的结构特征对Mtb抑制活性产生了 overall positive impact，可能有助于增强规避RNAP耐药的利福霉素同系物（如kanglemycins）的抗分枝杆菌活性。

实验部分

化合物5-30的合成、纯化、表征和logP测定可在参考文献中找到。本研究中的化合物均按照先前描述在同一批次中合成，并在深冻下储存。在分析前，所有化合物均评估了纯度，范围从94-95%。

生物测定

在100% DMSO中制备化合物5-30的10mM储备样品。在实验当天，在96孔圆底板中用 requisite生长培养基将储备液稀释两倍。每个样品使用6.25μM—0.012μM的浓度范围。异烟肼（Inh）和莫西沙星（Mox）和利福平（Rif）作为对照，浓度范围分别为62.5–0.122、6.25–0.012和6.25–0.012μM。每个测试板上包括最大抑制对照（0.15μM的Rif）和最小抑制对照（0.625% DMSO）。

在7H9ADCGLUTW、7H9ADCGLUTX和7H9CASGLUTW中培养的结核分枝杆菌H37RvMA培养物生长至光密度（OD600）为0.5–0.7，并在每种新鲜制备的培养基中制备500倍稀释液。将50μL稀释培养物（约1 X 10^4杆菌）添加到每个测试板的每个孔中，每孔最终体积为100μL。每个化合物重复测试两次。测定板在37°C、5% CO₂和加湿条件下培养7天。目测评分细胞沉淀，然后向测定板的每个孔中加入alamar blue试剂，再培养24小时。使用SpecraMax i3x酶标仪在第8天测量每个孔的相对荧光单位（RFU）（激发540 nm；发射590 nm）。使用GraphPad Prism-10，版本10.0.3进行数据分析。

涉及利福平和非达霉素耐药菌株的测定遵循相同的方案，不同之处在于化合物的生物学评估在62.5–0.122μM的浓度范围内进行。利福平、非达霉素、莫西沙星和异烟肼作为相关菌株的对照药物，浓度范围分别为0.15–0.0002、0.625–0.0012、6.25–0.012和62.5–0.122μM。每个测试板上包括最小生长对照（20μM的异烟肼）和最大生长对照（0.625% DMSO）。

培养基组成

7H9_ADC_GLU_TW：Middlebrook 7H9培养基（Difco），补充0.2%葡萄糖、Middlebrook albumin-dextrose-catalase（ADC） enrichment（Difco）和0.05% Tween 80。

7H9_ADC_GLU_TX：Middlebrook 7H9培养基（Difco），补充0.2%葡萄糖、Middlebrook albumin-dextrose-catalase（ADC） enrichment（Difco）和0.05% Tyloxapol。

7H9_CAS_GLU_TX：Middlebrook 7H9培养基（Difco），补充0.4%葡萄糖、0.03% Casitone（Gibco Bacto）和0.05% Tyloxapol。

致谢

作者感谢开普敦大学药物发现与开发中心（H3D）的Nashied Peton博士进行生物测定。CGLV感谢开普敦大学和南非国家研究基金会（NRF，资助号CPRR240314209156）的财政支持。

利益冲突

作者声明没有利益冲突。