CRISPR筛选揭示PIK3C2A介导头颈鳞癌EGFR抑制剂耐药新机制

　　本研究通过CRISPR全基因组及激酶组筛选，发现PIK3C2A是头颈鳞状细胞癌（HNSCC）对EGFR抑制剂耐药的关键新型介质。实验验证表明，敲低PIK3C2A可显著增强HNSCC细胞对吉非替尼的敏感性，为克服靶向治疗耐药提供了新策略和潜在联合治疗靶点。

　　

引言

头颈鳞状细胞癌（HNSCC）占所有头颈部恶性肿瘤的90%，是全球十大最常见癌症之一。据GLOBOCAN 2022数据，2022年新增病例超过89万，死亡人数超过48万。尽管手术及放化疗是主要治疗手段，但局部晚期、转移、高复发率和低生存率仍是HNSCC患者面临的严峻挑战。免疫检查点抑制剂如纳武利尤单抗和帕博利珠单抗虽在复发/转移性HNSCC中显示出生存获益，但应答率仅13%–18%。

表皮生长因子受体（EGFR）及其配体TGF-α在HNSCC中普遍过表达，分别见于92%和87.5%的肿瘤样本，且与患者生存期缩短相关。EGFR激活后可启动PI3K/AKT和RAS/MEK/ERK等下游信号通路，促进肿瘤生存、增殖、血管生成、侵袭和转移。因此，EGFR成为HNSCC治疗的重要靶点。EGFR抑制剂西妥昔单抗联合放疗已获FDA批准用于局部晚期HNSCC，但其单药疗效有限，应答率仅13%。其他EGFR靶向药物如吉非替尼、阿法替尼、帕尼单抗等临床试验结果亦不理想。

联合治疗通过多维度作用机制可克服耐药、提高疗效并降低毒性及复发风险。CRISPR/Cas9基因编辑平台的应用极大简化了哺乳动物系统遗传敲除阵列的构建，使得耐药关键驱动因子的筛选更加可行。本研究利用CRISPR文库在EGFR抑制剂耐药的HNSCC细胞系中进行筛选，旨在发现可增强EGFR抑制剂敏感性的基因敲除靶点。

方法

2.1 细胞培养

人UM-SCC和Detroit 562细胞系在DMEM培养基中培养，含10%热灭活胎牛血清、1%非必需氨基酸和1%青霉素-链霉素，于37°C、5% CO₂湿润环境中培养。使用MycoAlert检测试剂盒筛查支原体污染。

2.2 化合物处理

所有化合物先用DMSO溶解，后用培养基稀释至指定浓度。CRISPR文库整合后，细胞用1 μM吉非替尼或1 μM厄洛替尼处理，每组设三个复孔。Kinase文库样本的DMSO对照亦为三复孔，GeCKO文库样本设一个DMSO对照。CellTiter-Glo和流式细胞术分析在转染24小时后用DMSO或1 μM吉非替尼处理。

2.3 EGFR耐药分析

非UM-SCC细胞系的吉非替尼IC50值从“癌症药物敏感性基因组学”项目下载。Detroit 562的IC50通过刃天青细胞活力测定进一步确定。

2.4 CRISPR文库制备与分析

方法见支持信息。

2.5 siRNA转染

细胞接种24小时后，用DharmaFECT 1转染试剂、25 nM非靶向对照池（NTP）或25 nM PIK3C2A siRNA SMARTPool处理。siRNA和转染试剂在无血清DMEM中稀释，室温孵育5分钟后混合，再孵育20分钟。用无抗生素完全DMEM稀释siRNA至终浓度25 nM。

2.6 刃天青细胞活力测定

每孔2000个细胞接种于384孔板，用10点二倍稀释系列化合物或DMSO处理，四复孔。67.6 μM刃天青染色24小时后，用荧光酶标仪在540 nm激发和612 nm发射波长下检测荧光信号。

2.7 CellTiter-Glo活力测定

转染24小时后，加DMSO或1 μM吉非替尼处理48小时，加CellTiter-Glo试剂，室温振荡10分钟诱导细胞裂解，用Cytation 3酶标仪检测发光信号。

2.8 Annexin V细胞凋亡 assay

转染24小时后，加DMSO或1 μM吉非替尼处理48小时，收集悬浮和贴壁细胞，用FITC Annexin V和碘化丙啶（PI）染色，流式细胞仪分析凋亡。

2.9 细胞周期流式细胞术分析

处理同上，最后2小时加10 μM EdU，固定、透化后进行Click-iT反应，加FxCycle violet染色30分钟，流式细胞仪分析细胞周期。

2.10 qPCR

细胞用QIAzol裂解，RNeasy mini kit提取RNA，SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit合成cDNA，QuantiTect SYBR Green PCR Kit在QuantStudio 5上进行qPCR分析。引物序列见表1。

2.11 统计分析

GraphPad Prism 10进行统计分析，单因素ANOVA比较不同处理组均值。

结果

3.1 CRISPR筛选识别耐药介质

为识别HNSCC中EGFR靶向治疗耐药介质，我们在HNSCC细胞系中进行了全基因组和激酶组CRISPR/Cas9筛选。通过刃天青细胞活力测定筛选出对吉非替尼耐药的UM-SCC-49、UM-SCC-58、UM-SCC-97和UM-SCC-108细胞系进行后续筛选。图1A显示各细胞系对吉非替尼的响应，UM-SCC-108耐药性最高。图1B展示了负选择CRISPR筛选流程示意图，用于识别赋予EGFR抑制剂敏感性的基因敲除。

用GeCKO文库转导UM-SCC-49、UM-SCC-58和UM-SCC-108，嘌呤霉素选择后，用DMSO、1 μM吉非替尼或1 μM厄洛替尼处理。存活细胞基因组DNA分离后，通过测序量化gRNA。除UM-SCC-49 GeCKO v2A文库厄洛替尼处理组外，各条件文库多样性覆盖广泛。分析发现，三个细胞系在吉非替尼和厄洛替尼处理后均无共同显著耗竭基因，吉非替尼单独或厄洛替尼单独处理亦重叠极少。

鉴于GeCKO筛选共同基因较少，我们采用Human Kinase CRISPR Knockout Library并行筛选以增加统计效力。该文库虽靶基因较少，但每个基因gRNA数量更多（表2）。用该文库转导UM-SCC-49、UM-SCC-97和UM-SCC-108，DMSO、1 μM吉非替尼或1 μM厄洛替尼处理。测序显示多数条件下文库多样性覆盖超80%。

MAGeCK算法识别吉非替尼或厄洛替尼处理组相比对照显著耗竭的gRNA和基因。UM-SCC-49中，吉非替尼处理111个基因显著耗竭，厄洛替尼116个，65个基因共同；UM-SCC-108中，吉非替尼109个，厄洛替尼113个，31个重叠；UM-SCC-97中，吉非替尼155个，厄洛替尼119个，72个共同。UM-SCC-49和UM-SCC-97有9个共同基因，UM-SCC-49和UM-SCC-108有3个，UM-SCC-108和UM-SCC-97有3个。从GeCKO和Kinase文库筛选均显著的6个候选基因见表3，包括PIK3C2A、CDK12、PINK1、PDXK、MARVELD3、FGFR3。吉非替尼处理三个细胞系共同基因为8个，厄洛替尼处理为3个（图2B,C）。PIK3C2A是唯一在两种处理、三个细胞系中均显著耗竭的基因（图2A）。

3.2 PIK3C2A敲低增强EGFR抑制剂敏感性

鉴于PIK3C2A筛选结果一致且可能激活PI3K/mTOR信号节点，我们进一步研究其在EGFR抑制剂耐药中的作用。假设siRNA敲低PIK3C2A可增强耐药HNSCC细胞系对吉非替尼的敏感性。用转染试剂（Mock）、NTP或人PIK3C2A siRNA处理三个UM-SCC细胞系24小时，后加DMSO或吉非替尼处理48小时。与CRISPR结果一致，PIK3C2A siRNA加吉非替尼在UM-SCC-49和UM-SCC-97中活力最低。UM-SCC-49中，PIK3C2A siRNA + 吉非替尼较NTP + DMSO和NTP + 吉非替尼活力显著降低；UM-SCC-97中，较NTP + DMSO和PIK3C2A siRNA + DMSO显著降低。UM-SCC-108中，吉非替尼单独显著降低活力，但联合处理未进一步增强。Detroit 562（PIK3CA H1047R突变）吉非替尼耐药，IC50与UM-SCC细胞系相似。其中，PIK3C2A siRNA + 吉非替尼较NTP + DMSO、PIK3C2A siRNA + DMSO和NTP + 吉非替尼活力显著降低。qPCR验证72小时转染后敲低效率（图S3B）。总之，降低PIK3C2A mRNA水平可增强HNSCC细胞系对吉非替尼的敏感性。

3.3 机制探索

为解PIK3C2A mRNA下调如何增敏HNSCC细胞至吉非替尼，我们检测细胞周期和凋亡。选择Detroit 562因其对联合处理最敏感。细胞周期流式显示，吉非替尼处理减少S期细胞比例，但联合处理未进一步减少。G0/G1期分布无显著改变。凋亡分析显示，吉非替尼联合PIK3C2A siRNA凋亡细胞比例最高，但未达统计显著。

讨论

尽管EGFR及其配体在HNSCC中过表达且与肿瘤发生相关，但FDA批准或试验中的EGFR抑制剂单药疗效有限。鉴于遗传景观异质性和信号通路复杂交叉，HNSCC中EGFR抑制剂耐药机制尚未明确。既往研究显示PI3K和EGFR信号相互贡献耐药。我们团队前期工作表明吉非替尼联合PI3K抑制剂HS-173在某些HNSCC模型中有协同抑制潜力。Boehm等证明EGFR、STAT3和Bcl-X_L三重抑制在HNSCC细胞系中抗肿瘤效果更佳，EGFR和STAT3双重抑制在体内效果增强。这些研究详述了联合策略优势及识别HNSCC中EGFR抑制剂耐药关键介质的重要性。

本文采用全基因组无偏方法识别HNSCC中EGFR抑制剂耐药介质。用两个CRISPR筛选文库发现PIK3C2A是HNSCC细胞系对吉非替尼耐药的新型关键介质。验证实验表明敲低PIK3C2A可增强耐药HNSCC细胞对吉非替尼的敏感性。有趣的是，筛选策略多次处理可能识别出单时间点效应温和但随时间累积效应扩大的靶点。

人PI3K-C2α由PIK3C2A编码，属II类PI3Ks。Domin等首先克隆并表征PI3K-C2α，显示其广泛表达于人体组织，但对PI3K抑制剂渥曼青霉素和LY294002敏感性低于I类PI3K，表明PI3K-C2α可能通过其他信号通路而非经典PI3K/AKT通路驱动EGFR抑制剂耐药。确实，与致癌蛋白I类PI3Ks不同，PI3K-C2α在癌症中的作用存在争议，可能具组织和肿瘤特异性。Elis等报告敲低PI3K-C2α 75%足以诱导HeLa细胞凋亡，其他癌系活力亦随其抑制下降。Ng等在肝细胞癌（HCC）中的类似研究表明PIK3C2A siRNA通过caspase-3介导的凋亡减少HCC细胞增殖。相反，Dai等显示在透明细胞肾细胞癌中低PIK3C2A表达与高风险、不良预后和短总生存相关。Gulluni等最近报道了PI3K-C2α在乳腺癌中的详细功能：PI3K-C2α蛋白作为支架蛋白维持纺锤体稳定性，其下调抑制早期乳腺肿瘤增殖和发生，但因有丝分裂检查点缺陷促进后期肿瘤生长。PI3K-C2α缺失导致的纺锤体不稳定性增加乳腺癌模型对紫杉烷类治疗的敏感性。本研究首次证明PI3K-C2α在HNSCC中作为EGFR抑制剂耐药驱动因子，降低PIK3C2A转录水平导致生长抑制并增加对吉非替尼的敏感性，尤其在长期培养模型中。PI3K-C2α功能的相似性与差异性表明需进一步探索其肿瘤特异性作用。

我们还探究了EGFR和PI3K-C2α联合抑制增强生长抑制的潜在机制。虽未观测到凋亡显著增加，但Detroit 562联合处理组凋亡有升高趋势。细胞周期流式显示EGFR抑制单独足以减少S期细胞比例，而添加PI3K-C2α抑制未进一步增强细胞周期失调。鉴于CRISPR筛选实现PIK3C2A敲除且处理为长期多剂量EGFR抑制剂，siRNA敲除后短期EGFR抑制可能不足以揭示清晰机制。此外，仅凋亡可能不足，探索其他细胞死亡机制如DNA损伤、坏死和铁死亡有助于更好理解该联合如何克服HNSCC中EGFR抑制剂耐药。而且，需进行动物实验，通过植入PIK3C2A下调肿瘤或使用PI3K-C2α特异性抑制剂，以确定PI3K-C2α抑制能否增敏耐药HNSCC肿瘤至EGFR抑制。

总之，我们通过负选择CRISPR筛选和RNA干扰识别并验证PIK3C2A下调驱动HNSCC对EGFR抑制的敏感性。我们的工作证明该II类PI3K成员PI3K-C2α作为HNSCC中EGFR抑制剂耐药介质。本研究为未来更好理解HNSCC中EGFR抑制剂耐药提供见解，也可能指导开发特异性PI3K-C2α抑制剂及HNSCC患者新联合策略。