长读长测序揭示人脑神经精神疾病风险基因的RNA异构体谱及其功能影响

　　本研究利用纳米孔长读长扩增子测序结合新型生物信息工具IsoLamp，深度解析了31个高置信度神经精神疾病风险基因在人脑中的RNA异构体 repertoire。研究共鉴定出363种新型异构体和28个新型外显子，发现多个风险基因（如ATG13和GATAD2A）的主要表达源自未注释异构体，并通过质谱验证了ITIH4新型外显子跳跃事件的翻译产物。该研究为理解风险基因通过异构体多样性参与疾病机制提供了重要资源，并为靶向RNA剪接的治疗策略奠定基础。

　　

神经精神疾病是一类高度复杂的疾病，其发病风险与数百个基因组变异相关，这些变异通过改变风险基因的表达水平和RNA异构体构成来发挥作用。然而，这些基因如何通过表达改变和RNA剪接影响疾病风险和发生，目前仍知之甚少。近年来，全基因组关联研究（GWAS）已识别出大量与精神分裂症（SZ）、重度抑郁症（MDD）、自闭症谱系障碍（ASD）和双相情感障碍（BPD）相关的常见单核苷酸多态性（SNPs），但绝大多数风险变异位于非编码区，可能通过调控基因表达或剪接来发挥作用。由于人脑具有独特的剪接程序，包括大量组织特异性外显子和微外显子的频繁使用，因此全面解析风险基因的RNA异构体 repertoire 对于揭示疾病病理生理机制至关重要。

传统短读长测序技术（如Illumina）在检测新型剪接事件方面存在局限性，尤其对于较长、较复杂的基因，无法提供长距离外显子连接信息。相反，长读长测序技术（如牛津纳米孔技术ONT和Pacific Biosciences）能够单次读取完整异构体序列，从而更准确地进行异构体分析。为此，研究人员开发了新型生物信息学流程IsoLamp，专门用于从长读长扩增子测序数据中识别和量化RNA异构体。

本研究采用纳米孔长读长扩增子测序技术，对31个候选神经精神疾病风险基因进行了深度分析。样本来源于5名健康个体的7个脑区（包括前额叶皮层、尾状核和小脑等），通过设计覆盖目标基因完整编码区（CDS）的引物，成功捕获了尽可能多的潜在异构体。利用IsoLamp流程，研究人员对测序数据进行了优化处理，包括读长映射、异构体识别和表达量化，并通过表达过滤去除了低置信度的异构体。

关键技术方法包括：从人脑死后组织提取总RNA，通过长距离PCR扩增目标基因CDS，使用纳米孔技术进行长读长测序，并利用新开发的IsoLamp流程进行异构体发现和量化。该流程经过合成RNA标准品（SIRV）的基准测试，显示其在精确度、召回率和定量准确性方面均优于其他工具（如Bambu、FLAIR等）。此外，研究还通过RT-PCR和Sanger测序验证了新型外显子，并采用靶向和非靶向质谱技术（MS）检测了新型异构体的翻译产物。

研究结果

IsoLamp：长读长扩增子测序的RNA异构体发现工具

研究人员开发了IsoLamp流程，专门用于从长读长扩增子数据中识别和量化RNA异构体。通过使用SIRV合成RNA标准品进行基准测试，IsoLamp在精确度、召回率和定量准确性方面均表现优异，显著优于其他现有工具（如Bambu、FLAIR、FLAMES和StringTie2）。该流程还包含表达过滤功能，可去除低表达异构体，减少假阳性。

死后人脑RNA的数量和质量

从5名健康个体的7个脑区提取的RNA质量良好，RINe平均值為7.4（范围6-8.1）。主成分分析（PCA）显示，小脑样本与皮层区域在PC1上分离，而个体差异（如样本pH和RINe）在PC2上驱动变异。

长读长测序识别363种新型RNA异构体

对31个神经精神疾病风险基因的分析共鉴定出872种已知和新型异构体，经表达过滤后保留441种高置信度异构体。其中，78种为已知异构体（全剪接匹配FSM），256种为使用已知剪接位点的新型异构体（NIC），107种为包含至少一个新型剪接位点的异构体（NNC）。新型异构体的比例因基因而异，例如GATAD2A中96.9%的表达源自新型异构体，而GRIN2A则未检测到新型异构体。

高表达新型异构体的检测

多个基因的新型异构体表达量较高，例如精神分裂症风险基因ATG13的新型异构体占其总表达的64%，其中最丰富的异构体Tx26（占23%）跳过了经典外显子12。钙通道基因CACNA1C中，22种新型异构体复现了先前发现的剪接热点（外显子7区域）。

新型异构体改变预测蛋白结构

研究发现新型异构体可能通过影响开放阅读框（ORF）或蛋白结构来功能。例如，ITIH4的新型异构体（Tx71）跳过外显子22，经质谱验证其翻译产物，预测导致106个氨基酸的缺失，影响其35 kDa重链结构域。GABBR2的新型异构体Tx29跳过外显子5，可能破坏其蛋白结构和功能。

脑区特异性表达的新型异构体

小脑组织中多个新型异构体表达显著升高，例如DCC的Tx9在小脑中的表达量是皮层区域的10倍。DOC2A的Tx53在尾状核中特异性高表达，表明这些异构体可能具有脑区特异性功能。

新型外显子的测序与验证

通过RT-PCR和Sanger测序，研究人员成功验证了21个新型外显子（涉及10个基因）。其中76%为“毒害外显子”（含有提前终止密码子PTC），可能触发无义介导的mRNA降解（NMD）。但部分外显子（如NEGR1和XRN2中的）因距离最后的外显子连接点<50 nt，可能逃避NMD。

结论与讨论

本研究通过长读长测序技术全面描绘了神经精神疾病风险基因的RNA异构体 repertoire，揭示了当前参考注释的不完整性。共鉴定出363种新型异构体和28个新型外显子，其中多个异构体表达量高且可能通过改变蛋白结构或功能参与疾病机制。例如，ATG13、CSMD1和GATAD2A等基因的新型异构体占主导表达，提示它们可能在神经精神疾病中发挥关键作用。

研究还发现新型异构体具有脑区特异性表达模式，如小脑中DCC和DOC2A的异构体表达显著升高，这表明异构体多样性可能与特定脑区的生理功能相关。通过质谱验证，研究确认了ITIH4和GABBR2新型剪接事件的翻译产物，为这些异构体的功能研究提供了蛋白水平证据。

这些发现不仅丰富了我们对人脑转录组复杂性的理解，还为未来研究提供了重要资源。例如，新型异构体可能成为药物靶点，通过反义寡核苷酸或CRISPR技术调控剪接过程，从而为神经精神疾病的治疗提供新策略。此外，IsoLamp流程的开发和优化为长读长扩增子数据的分析提供了高效工具，有助于进一步探索其他疾病相关基因的异构体多样性。

总之，本研究强调了长读长测序在揭示RNA异构体多样性方面的重要价值，为理解神经精神疾病的分子机制奠定了基础。未来研究应进一步探索这些新型异构体的功能影响，以及它们如何通过遗传变异与疾病风险相关联。