综述：利用CRISPR技术推动染色体基因多样化和人工进化

　　这篇综述系统阐述了CRISPR技术如何革新染色体基因多样化和人工进化领域。文章详细比较了CRISPR介导的同源定向修复（HDR）、碱基编辑（BE）、引物编辑（PE）等技术在功能基因组学研究、蛋白质进化、代谢工程和疾病建模中的应用，重点分析了各种方法的编辑窗口、突变类型和适用范围，为（定向进化）、（功能基因组筛选）和（合成生物学）提供了重要技术参考。

　　

引言

基因多样化是产生大量遗传变异体的过程，有助于功能序列的筛选分析。通过迭代多样化和选择，可以改进基因和蛋白质功能，推动生物技术创新。传统方法如易错PCR、位点饱和突变和DNA改组存在局限性，通常需要将突变文库引入宿主生物并进行异位表达，这既繁琐又受宿主依赖的转化效率限制。虽然体内连续进化系统避免了迭代克隆和转化步骤，但仍需在质粒或非天然基因组位点表达目的基因，无法模拟内源调控环境。此外，一些物种（如植物）中尚未建立异位表达系统，且大型结构变异（如大片段缺失、重复、倒位和易位）在体外合成成本高昂。

染色体基因多样化指在天然染色体位置直接产生遗传变异，支持可靠的原位功能分析。传统方法如自发、化学或物理诱变效率低、突变频率低，且突变在全基因组随机分布。寡核苷酸介导的重组工程是向染色体基因多样化迈出的重要一步，但迄今仅成功应用于细菌物种和酵母转基因。近年来，传统重组工程通过使用CRISPR/Cas系统产生靶向DNA双链断裂（DSB）来提高诱变频率，促进了基于同源定向修复（HDR）的变异工程方法在细菌、酵母和人类细胞系中的发展。其他不依赖重组的方法也得以开发，使同源重组效率低的物种实现基因多样化。这些方法包括使用失活或切口Cas蛋白与脱氨酶、逆转录酶和易错DNA聚合酶结合。借助CRISPR技术，通过简单地生成单导RNA（sgRNA）文库即可实现大规模靶向染色体基因多样化，支持快速探究多种物种中的细胞过程，并助力从治疗药物到生物基产品等有用产品的开发。

CRISPR系统助力可编程基因组靶向

CRISPR/Cas系统是细菌的先天免疫系统，能够识别、结合和切割外来核酸。根据效应复合体结构，CRISPR/Cas系统分为两大类和六种类型。1类系统使用多亚基效应复合体，包括I型（标志蛋白：Cas3）、III型（Cas10）和IV型系统。2类系统使用单蛋白效应器，包括II型（Cas9）、V型（Cas12）和VI型（Cas13）。值得注意的是，Cas9和Cas12主要靶向DNA，而Cas13专门用于RNA切割。自发现以来，各种CRISPR/Cas系统已被改造和重编程为精确基因组编辑工具。迄今最广泛使用的系统是化脓链球菌的II类CRISPR/Cas9系统。在该系统中，Cas9蛋白通过sgRNA靶向至被称为原间隔区的基因组位点，其序列与原间隔区相邻基序（PAM）相邻，并与sgRNA的引导序列匹配。随后切割目标DNA产生DSB，通过宿主细胞的非同源末端连接（NHEJ）或HDR途径修复。dCas9（失活Cas9）和nCas9（切口酶Cas9）是通过使Cas9的两个核酸酶结构域（HNH和RuvC）失活（dCas9）或单个核酸酶结构域（nCas9）获得的突变体。dCas9缺乏DNA切割活性，但保留准确靶向和结合DNA的能力，使其成为附加效应蛋白的招募平台。nCas9保留切割一条DNA链的能力，促进高级基因组编辑技术如碱基编辑和引物编辑。

CRISPR辅助基因多样化

染色体基因多样化通常需要使用覆盖目标区域的基因组编辑剂文库。早期基因组编辑工具，即锌指核酸酶（ZFNs）和转录激活因子样效应物核酸酶（TALENs），存在蛋白质设计复杂、分子克隆成本高以及仅具切割功能等问题，阻碍了基因多样化文库的简便生成。因此，TALEN文库主要用于基因敲除。直到最近，利用先进机器学习模型才解决了设计特定锌指阵列的挑战。相比之下，CRISPR/Cas系统的高效性、易编程性和成本效益推动了其在不同物种中的广泛应用。通过简单构建sgRNA文库，CRISPR的靶向范围即可覆盖完整基因或长基因组区域。

CRISPR刺激的同源定向修复

由于对HDR高度保守机制和成熟实验协议的数十年研究，HDR首先被用于引入用户定义的精确突变库并不令人惊讶。体内自发同源重组效率通常较低。一项里程碑研究表明，人工引入的DSB通过触发同源重组修复途径，大大提高了携带同源序列的外源DNA的靶向整合效率。这种提升的效率允许使用大规模体外合成的HDR模板进行基因组整合，这些模板包含合理设计或饱和突变，遵循CRISPR/Cas9的DNA切割（本文中称为CRISPR-HDR策略）。

在人类细胞系中首次证明，可以使用饱和编辑对染色体基因进行多样化，这涉及通过sgRNA进行单次基因组切割，随后与体外合成的诱变供体质粒文库进行重组。此后，多项研究报道使用CRISPR结合同源重组进行饱和编辑和功能分析，针对各种疾病相关基因的外显子区域。与传统方法不同，CRISPR-HDR能够高通量生成和分析遗传变异，包括那些意义不确定的变异。通过引入靶向突变并在选择（如药物治疗）前后跟踪变异丰度，研究人员可以更快速地系统评估这些变异的功能影响。然而，由于哺乳动物细胞中HDR效率普遍较低，针对每个外显子的HDR模板通常需要两侧600至1000核苷酸长的同源臂以支持有效修复。在酵母中，开发了一种类似的方法称为Cas9介导的蛋白质进化反应（CasPER）。CasPER方法是一种稳健的定向进化技术，使用易错PCR（epPCR）创建大型突变文库，并通过Cas9介导的基因组编辑将这些变异整合到基因组环境中。CasPER允许以超过98%的效率整合300至600 bp的供体序列。该方法已证明可用于多样化内源非必需酵母基因，如甲羟戊酸途径基因，从而生成多样突变体并在选择后将类异戊二烯产量提高11倍。

虽然上述研究证明了使用单个sgRNA整合供体文库的可行性，但突变掺入效率在远离Cas9切割位点处趋于下降。因此，对每个预期突变使用附近的sgRNA是有利的。这种方法在同源重组系统高效的生物体（如某些工程细菌或酵母）中可行，其中较短的同源臂（通常40-100 bp）足够，因此允许大规模并行合成供体和附近引导物。基于这一概念，在大肠杆菌中开发了一种名为CRISPR启用可追踪基因组工程（CREATE）的基因多样化技术。CREATE整合CRISPR/Cas9与HDR，使用引导和供体对文库实现染色体基因的饱和突变。在该策略中，供体必须提供在sgRNA表达质粒上，以便引导和供体对物理连接并递送至同一细胞。在酵母中，我们也证明供体可以提供在sgRNA表达质粒上以实现高效基因编辑。使用类似的引导+供体策略，我们和其他人通过CRISPR-HDR在酵母中实现了基因多样化。我们的策略CHAnGE（CRISPR-Cas9和同源定向修复辅助的基因组规模工程）能够使用质粒文库进行染色体基因多样化和全基因组基因敲除。最近，我们通过使用PAM宽松的Cas9变体扩展了其靶向范围，并实现了CRISPR-Cas9和同源定向修复辅助的饱和编辑（称为CHASE）。使用概念上类似的方法，Roy等人开发了多重精确基因组编辑与短可追踪整合细胞条形码（MAGESTIC）。在该系统中，通过将供体DNA主动招募至Cas9切割位点，编辑效率提高了五倍以上，平均达到60%。此外，MAGESTIC通过基因组整合突变追踪条形码，提高了下游功能选择过程中突变追踪的保真度。同一引导+供体策略的其他变体也能够通过微小适应执行染色体基因多样化。

这些能够进行大规模多样化的CRISPR-HDR平台（CREATE、CHAnGE、MAGESTIC等）对微生物菌株工程特别具有变革性——该领域需要精确遗传修饰结合快速表型表征以用于工业应用。虽然传统的适应性实验室进化仍然广泛用于工业菌株改进，但CRISPR辅助的多样化现在提供了一种靶向替代方案，显著加速了这一过程。CRISPR-HDR的多功能性已通过成功多样化各种靶标得到证明，包括代谢基因、转录因子和启动子，促进了关键工业表型（如应激耐受）的进化。通过同时和可追踪地诱变代谢途径和调控元件，这些系统克服了先前通过数月非靶向进化解决的挑战。

虽然基于DNA的供体模板常用于CRISPR-HDR应用，但RNA也被证明可作为酵母中DSB修复的供体。鉴于此，CRISPR和RNA辅助的体内定向进化（CRAIDE）使用嵌合供体gRNA（cgRNA）进行Cas9靶向和DSB修复。cgRNA由易错T7 RNA聚合酶（epT7RNAP）持续产生，该酶将随机突变引入RNA模板，以整合到靶位点。CRAIDE用于通过靶向精氨酸转运体进化耐药性。然而，该方法的突变率比其他异位体内进化方法低2-3个数量级。其在进化复杂和工业相关性状方面的应用尚未探索。

尽管CRISPR-HDR方法在突变设计方面用途广泛，但Cas9切割可在靶位点产生随机插入和缺失，尤其是在偏好NHEJ的哺乳动物细胞系中。此外，靶向和脱靶切割可能导致染色体结构异常，如意外易位和大染色体片段丢失，可能混淆遗传变异功能的解释。为避免此问题，研究人员利用在单倍体细胞系或菌株中研究必需基因的优势，其中致死性indel和结构异常被清除，仅保留成功的HDR事件。除了indel和染色体不稳定的挑战外，CRISPR-HDR仅限于具有HR能力的细胞或细胞周期的特定阶段。因此，在某些应用和物种中，需要无DSB且不依赖HDR的方法。

CRISPR引导的脱氨酶

此处我们首先说明使用一种不依赖HDR的方法，即CRISPR引导的脱氨酶，进行染色体基因多样化，其中相关脱氨酶直接转换核苷酸类型，无需DSB。

Cas9-脱氨酶融合物/复合物

脱氨酶如激活诱导胞苷脱氨酶（AID）在CRISPR时代之前已被用于通过劫持Ramos B细胞中的天然体细胞超突变系统生成异源基因的遗传多样性。碱基编辑（BE）技术进一步使脱氨酶具有靶向可编程性，并在不同宿主细胞中得到更广泛的应用。第一代碱基编辑器将胞苷脱氨酶（CDA）与dCas9融合，诱导非模板链上的胞嘧啶脱氨基为尿嘧啶。在DNA复制过程中，该尿嘧啶被误识别为胸腺嘧啶，导致C:G至T:A的转换。为扩展突变类型，胞苷脱氨酶被腺苷脱氨酶（ADA）取代，从而发明了腺嘌呤碱基编辑器（ABE）。该编辑器介导腺嘌呤脱氨基为次黄嘌呤，在DNA复制过程中被识别为鸟嘌呤，实现A:T至G:C的转换。

两种碱基编辑工具，即靶向AID介导的诱变（TAM）和CRISPR-X，证明了胞苷碱基编辑器（CBEs）在指定染色体位点快速执行遗传多样化的能力。两种工具都整合了与AID复合的dCas9，能够在sgRNA引导下在目标区域产生广泛的单核苷酸突变。这些工具采用不同的胞苷脱氨酶招募策略。TAM将AIDx（一种AID变体）融合到dCas9的C末端，而CRISPR-X使用修饰的sgRNA支架，其茎环结构包含两个MS2结合位点，以招募与MS2蛋白融合的AID或高活性AID变体（AID*△）。

为增强突变类型的多样性，已开发了几种双碱基编辑工具。其中第一个工具饱和靶向内源诱变编辑器（STEMEs）将胞苷脱氨酶（APOBEC3）和腺苷脱氨酶（ecTadA-ecTadA7.10）以不同配置融合到nCas9的C末端。这允许在同一原间隔区内同时进行C至T和A至G的转换。通过进一步使用识别NG PAM序列的PAM柔性Cas9，STEME-NG实现了对56个氨基酸序列的近饱和诱变。除了常见的C:G至T:A和A:T至G:C转换外，STEME-NG还促进了较少见的C至G/A转换。靶向水稻乙酰辅酶A羧化酶（由OsACC基因编码）的羧基末端结构域的400个氨基酸，STEMEs成功诱导了具有增强除草剂抗性的突变体，并产生了多重突变。此外，不使用融合蛋白，多重正交碱基编辑（MoBE）也使用sgRNA支架同时招募ADA（TadA9）和CDA（CDA1），利用正交茎环实现随机双碱基编辑，这似乎是植物中CRISPR-X的升级版。

为提高基因治疗的编辑效率和准确性，CBEs最初设计为融合尿嘧啶糖基化酶抑制剂（UGI）以防止在通过错配修复去除尿嘧啶后形成无嘌呤/无嘧啶（AP）位点。对于基因多样化，消除UGI或用尿嘧啶DNA N-糖基化酶（UNG）替代可增强AP位点的形成，并促进目标序列的更多样化编辑。使用该策略，C至G碱基编辑器（CGBEs）通过省略UGI并掺入eUNG（来自大肠杆菌的UNG变体）实现高效的C至G颠换，同时仍保留较少见的C至A/T转换。在此基础上，miniAGBE将ABEs与CGBE结合，同时在靶位点产生A至G和C至G/T/A转换，编辑窗口分别为A₄-A₈和C₃-C₁₃。在耐药筛选中，通过使用miniAGBE对