ScIsoX：单细胞异构体水平转录组复杂性的多维测量框架及其应用

　　为解决单细胞异构体分析中缺乏系统性测量转录组复杂性框架的问题，研究人员开发了ScIsoX计算框架。该框架整合了新型单细胞层次张量（SCHT）数据结构、一套复杂性度量指标及专用可视化工具，能够系统探索由选择性剪接产生的全局和细胞类型特异性异构体表达模式，揭示传统基因水平方法常遗漏的多维复杂性特征，为研究转录组调控提供了新视角。

　　

在生命科学领域，转录组的复杂性一直是研究者关注的焦点。选择性剪接（alternative splicing）作为真核细胞中增加功能多样性的关键机制，能够从有限数量的基因产生多种转录本异构体。近年来，单细胞异构体分析技术的进步使得我们能够在前所未有的分辨率下全面表征转录本的多样性。目前存在两种互补的方法：短读长测序技术虽然通量高，但在异构体分辨率上存在局限；长读长测序技术则能够提供全长转录本表征，尽管通量较低。然而，无论是哪种平台，目前都缺乏能够在单细胞分辨率下测量和解释转录组复杂性多维性质的分析框架。这导致我们无法充分利用异构体分辨率数据所提供的额外信息层，从而错失了深入理解转录组调控机制的机会。

当前的单细胞异构体数据分析面临三大挑战。首先，传统的数据结构对多维复杂性分析存在限制。基因-细胞计数矩阵无法捕捉异构体使用的复杂性和可变性，而带有基因ID作为元数据的转录本-细胞矩阵虽然更为流行，但在分析过程中需要重复进行元数据查找和数据重组，以识别哪些转录本属于同一基因，导致计算效率低下。其次，试图将基因水平和异构体水平计数矩阵合并为“细胞×基因×异构体”张量的方法需要进行大量的零填充以适应基因特异性异构体数量的变异，从而产生稀疏的三维张量，内存需求巨大。第三，现有的分析方法虽然擅长于异构体发现和量化，但缺乏全面的度量指标来解决关于异构体表达模式跨细胞和细胞类型组织原则的基本问题。

为了应对这些挑战，研究人员开发了ScIsoX计算框架。该框架整合了新型单细胞层次张量（SCHT）数据结构、一套复杂性度量指标及专用可视化工具，能够系统探索由选择性剪接产生的全局和细胞类型特异性异构体表达模式。ScIsoX的核心是SCHT，它将异构体水平计数数据组织成基因特异性子张量，每个基因由一个包含异构体-细胞表达值的独立计数矩阵表示。这种基于分区的设计保留了内在的层次结构，无需进行大量的零填充，从而实现了既具有生物学意义又计算高效的表示。当整合细胞类型信息时，SCHT会扩展为包含细胞类型作为额外维度。

基于这一结构，ScIsoX通过七个核心度量指标来概念化转录组复杂性，每个指标捕捉异构体表达模式的不同维度。主要维度包括（I）细胞内异构体多样性（即基因在单个细胞内共表达多个异构体的倾向）、（II）细胞间异构体多样性（即基因在整个细胞群体中表达的异构体多样性）、（III）细胞内类型异质性（即细胞间异构体使用的变异）和（IV）细胞间类型特异性（即细胞类型特异性异构体使用的度量）。三个额外的高阶度量指标测量这些模式的变异性，以确定（V）细胞异质性是否集中在特定细胞类型中、（VI）细胞类型特异性差异是否发生在特定谱系之间以及（VII）异构体共表达模式是否跨细胞类型变化。

为了补充这些核心度量，研究人员还提供了额外的表征指标，以捕捉异构体使用的特定方面。通过分析三个不同的单细胞异构体数据集，研究人员证实了ScIsoX的实用性。这些数据集调查了（1）通过纳米孔测序的小鼠造血发育、（2）通过纳米孔测序的小鼠和人类大脑发育以及（3）通过PacBio的Kinnex协议的人类外周血单核细胞（PBMCs）。这些数据集代表了根本不同的生物系统，同时采用了不同的异构体测序技术方法，从而能够全面评估框架的性能和广泛适用性。

分析揭示了这些系统中显著不同的转录组复杂性模式，突出了通过该方法独特可及的生物学见解。转录组复杂性分析评估了不同的异构体表达模式，这些模式非随机分布。小鼠造血发育表现出双峰模式，以低异构体多样性和低细胞类型特异性为主（Q3：52.89%），较少基因显示细胞类型特异性表达（Q1+Q2：32.85%）。小鼠大脑发育数据集也表现出类似的双峰模式，显示出跨象限的显著多样性及明显聚类。相比之下，人类PBMC数据集与两个发育数据集相比分布显著不同，显示出细胞间异构体多样性与细胞间类型特异性之间的强正相关。这种紧密相关性表明，在特化的免疫细胞中，异构体多样性与细胞类型特异性功能密切相连。

两个发育数据集显示出比PBMCs更大的特异性/多样性关系范围，反映了发育中比特化免疫细胞更大的转录组异质性，后者需要特定的异构体转换事件以进行状态转换和响应细胞信号。该框架独特地识别出具有有趣复杂性特征的基因，这些基因可能被常规单细胞数据分析遗漏。例如，所有数据集中的绝大多数基因表现出比细胞内多样性更高的细胞间多样性，证明了一个基本原则：基因倾向于表达细胞类型特异性异构体，而不是在每个细胞类型中表达多个异构体。然而，可以识别出一个细胞内多样性高于其细胞间多样性的基因子集，表明在单个细胞内多个异构体的协调共表达，而非细胞特异性异构体选择。这些基因可能需要特定的相互依赖的异构体关系以实现正常功能，代表了一种独特的调控机制，值得进一步研究。

共表达分析揭示了协调剪接的独特模式。例如，在小鼠造血发育中，转录因子Irf8（干扰素调节因子8，对髓系谱系决定和免疫细胞分化至关重要）显示出多个共表达异构体簇。对Irf8共表达模式的深入分析显示，这些模式代表了多种不同的动态调控方式。研究人员发现一个异构体对（ENSMUST00000160388:Irf8-202与ENSMUST00000162001:Irf8-205）表现出规范蛋白质编码转录本和内含子保留变体之间阶段特异性共表达的显著模式。相比之下，另一个对（ENSMUST00000047737:Irf8-201与ENSMUST00000160943:Irf8-204）显示出混合调控关系，对应于全长和截短蛋白质编码异构体之间的细胞类型特异性转换。这些发现共同强调了控制这一主转录因子的复杂、多层策略，可能涉及非编码RNA的转录后缓冲和通过蛋白质异构体转换的功能微调。

ScIsoX还能够追踪表达异构体比例跨细胞类型的变化，进一步突出异构体使用的动态变化，例如跨谱系或发育阶段。此外，ScIsoX有助于详细检查基因的细胞类型特异性复杂性特征。例如，基因MS4A1（编码B淋巴细胞抗原CD20）在人类PBMCs中表现出独特的异构体表达模式，不同的免疫细胞类型显示不同的异构体共表达特征。值得注意的是，MS4A1在多样性分析中落在对角线以下，在大多数PBMC细胞类型中多个异构体持续共表达，表明其功能依赖于跨不同免疫细胞类型的特定异构体组合的协调相互作用。

与将异构体多样性视为单一维度的现有方法不同，ScIsoX既提供了转录组复杂性的多面视图，又使研究人员能够产生关于选择性剪接功能重要性的可检验假设，例如跨发育时间点或解剖区域。例如，ScIsoX揭示了跨出生后发育阶段细胞内异构体多样性的独特模式，具有显示阶段特异性异构体表达特征的明显基因簇。热图说明了某些基因群在整个发育过程中保持持续高多样性（深紫色），而其他基因显示阶段特异性多样性模式。此外，ScIsoX揭示了细胞间异构体多样性和细胞间类型特异性的独特模式，这些模式在整个大脑发育过程中动态演化，并且在大脑区域之间显著不同。

复杂性度量的结构化组织和层次张量格式促进了与互补单细胞分析方法的整合。定量度量可以与差异表达模式相关联，以识别表达水平与异构体调控机制之间的关系，使研究人员能够将转录组复杂性的变化与跨条件的表达水平改变联系起来。转录组复杂性特征也可以与DNA结合 motif 富集模式相关联，以识别驱动特定复杂性特征的潜在调控元件。此外，框架的细胞类型解析度量可以映射到轨迹推断结果上，例如以表征细胞分化过程中异构体使用机制的动态变化。分类系统能够将复杂性维度纳入基因调控网络分析，可能揭示剪接调控因子如何影响网络拓扑和动力学。而且，这些度量支持跨物种比较，以研究异构体调控模式的进化保守性。

特别令人感兴趣的是与差异转录本使用（DTU）方法（如DTUrtle和Sierra）的互补关系。虽然这些已建立的DTU方法擅长比较分析，识别实验条件之间转录本比例的统计显著变化，但ScIsoX通过系统表征内在转录组复杂性模式解决了一个根本不同的分析问题。不是问“哪些基因在条件之间显示差异异构体使用？”，我们的框架问“什么复杂性模式表征数据集内的异构体表达？”这创造了增强分析工作流的机会，其中ScIsoX复杂性特征可以作为先验信息来指导DTU研究设计，将比较分析导向具有适当复杂性特征的基因（例如，专注于具有多异构体表达的基因而非二元转换），而DTU结果当通过ScIsoX的复杂性景观解释时获得更深的生物学背景。

虽然这些机会突出了框架的潜力，但在应用和解释ScIsoX结果时应考虑几个重要因素。首先，ScIsoX度量的有效性取决于上游数据的质量。在使用ScIsoX之前进行严格的工作流对于可靠的结果至关重要。研究人员建议用户使用已建立的、平台适当的工具进行异构体量化和过滤，并在实验设计需要时应用批次校正。虽然ScIsoX包括内部过滤步骤，这些旨在减轻残留噪声，但不能替代稳健的上游质量控制。

其次，几个度量的准确性取决于高质量的细胞类型注释。虽然框架与任何流行的单细胞聚类和注释方法兼容，但细胞类型定义的质量将影响特定度量的准确性，特别是那些基于细胞类型比较的度量。在细胞类型边界模糊或注释不确定的情况下，用户应谨慎解释结果或专注于不依赖于细胞类型信息的度量。

第三，ScIsoX主要提供转录组复杂性模式的描述性度量和探索性可视化。虽然共表达分析模块包括统计检验（FDR校正、bootstrap稳定性），但核心复杂性度量不包括用于跨条件比较的p值。对于跨条件的正式统计比较，建议导出复杂性度量并应用适合特定实验设计和生物学问题的适当统计检验。

第四，用户应注意分析工作流旨在专注于具有可检测多异构体表达的基因。因此，在质量控制后发现仅表达单个异构体的基因被排除在复杂性分析之外。此过滤步骤对于有意义的解释至关重要，但可能减少最终考虑的基因数量。改进的测序质量和深度可以通过实现更全面的异构体检测来显著缓解此问题。如果用户希望最大化后续分析中的基因数量，可以在SCHT创建期间增加nhvg参数，尽管此值不能超过数据集中存在的基因总数。

最后，虽然层次数据结构为典型单细胞数据集提供了计算优势，但极大的数据集可能仍需要额外的优化策略。框架包括批处理方式和内存高效数据处理的选项以应对这些场景。

总之，ScIsoX建立了第一个全面的框架，用于系统测量和可视化跨平台单细胞测序数据中的异构体水平转录组复杂性。通过其新颖的层次数据结构，ScIsoX捕捉了基因、细胞类型和细胞群体水平复杂性的不同维度，生成了对转录组调控的异构体水平见解，这些见解常被常规基因水平分析遗漏。ScIsoX的多维复杂性度量和直观可视化为研究选择性剪接的功能作用提供了基础，例如在细胞分化、发育和疾病背景下跨多样生物系统。通过使用标准R对象作为其核心数据结构和度量，ScIsoX创造了未来与其他组学层和分析方法整合的机会，将该框架定位为单细胞分析生态系统中的有价值补充。该框架处理来自不同测序平台的异构体计数矩阵，使多维复杂性分析广泛可及，尽管用户在解释复杂性度量和其他关键因素时应考虑平台特异性限制。

在方法学上，研究人员主要运用了单细胞层次张量（SCHT）数据结构构建、质量控制与归一化处理、高变基因识别、七维转录组复杂性度量框架（包括细胞内/间异构体多样性、细胞内类型异质性、细胞间类型特异性等）、统计验证与阈值优化算法、以及全面的可视化分析工具。数据集来源包括小鼠造血发育（纳米孔测序）、鼠脑与人脑发育（纳米孔测序）及人类PBMCs（PacBio Kinnex协议）。

研究结果通过多个维度展开：首先，通过SCHT数据结构高效组织异构体表达数据，避免了传统方法的内存浪费问题；其次，七种核心复杂度度量揭示了不同生物系统中异构体表达模式的显著差异，如造血发育与免疫细胞的特异性模式对比；第三，共表达分析发现关键基因（如Irf8）存在多层级调控策略，结合编码与非编码异构体的协同作用；第四，动态追踪技术成功捕捉到发育过程中异构体比例的变化（如Alt1在造血发育中的转换）；最后，细胞类型特异性分析揭示了像MS4A1这样的基因在免疫细胞中保持多异构体共表达的特殊模式。

结论部分强调，ScIsoX首次实现了单细胞异构体水平复杂性的系统量化，突破了传统基因水平分析的局限。该框架不仅能发现被常规方法忽略的异构体协调表达模式，还为理解选择性剪接在发育、免疫应答等过程中的功能机制提供了新视角。通过标准化数据结构和度量体系，它为多组学整合及跨物种比较研究奠定了基础，最终推动转录组调控研究向更高精度和深度发展。