TRDMT1基因多态性与神经母细胞瘤易感性的关联：一项病例对照研究的深入解析

　　本研究发现TRDMT1基因关键多态性位点（rs7074891 T>C, rs10904887 T>C, rs2273734 C>T）与中国江苏儿童神经母细胞瘤（Neuroblastoma）易感性显著相关。研究通过多维度分析（包括表达数量性状位点/eQTL、生存分析和临床相关性分析）揭示，这些单核苷酸多态性（SNP）不仅影响TRDMT1表达水平（如rs7074891 C等位基因提升表达，而rs2273734 T等位基因降低表达），且与高风险临床特征（如MYCN扩增、国际神经母细胞瘤分期系统/INSS晚期）和不良预后（总体生存/OS及无事件生存/EFS）密切相关。研究成果为神经母细胞瘤的遗传风险评估和靶向治疗提供了新的生物标志物和理论依据。

　　

引言

神经母细胞瘤是儿童中最常见的颅外实体肿瘤，占所有儿科恶性肿瘤的8%，死亡率高达15%。这种肿瘤表现出高度的临床和分子异质性，可发生于交感神经系统的任何部位，并在不同患者中呈现 distinct 的基因表达谱。临床上，根据诊断年龄、疾病分期、组织病理学特征、MYCN扩增状态和其他遗传标志物等因素，神经母细胞瘤患者被分为低危、中危和高危组。尽管低危和中危患者通过手术和有限化疗通常可实现超过90%的总体生存率，但高危神经母细胞瘤仍然是一个挑战，生存率低于50%，且复发风险高，突显了对更强化和个性化治疗策略的需求。

近年来，越来越多的遗传多态性和生物标志物被识别出来，有助于风险分层，并为个性化治疗策略提供了宝贵的见解。例如，MYCN扩增、ALK突变、TP53突变和ATRX突变等遗传改变已被证明与高危神经母细胞瘤密切相关。进一步探索神经母细胞瘤的遗传和分子机制对于识别新的治疗靶点和改善高危患者预后至关重要。

全基因组关联研究（GWAS）已成为识别遗传风险因素的有力工具，通过在大规模病例对照队列中分析全基因组数百万个单核苷酸多态性（SNP）。已经识别出几个关键的易感位点，与BARD1、TP53、CASC15、CHEK2、AXIN2、LIN28B和LMO1等基因的变异显著相关，这些基因通过调节DNA损伤修复、细胞增殖和凋亡等途径参与肿瘤发生。尽管取得了这些进展，神经母细胞瘤的遗传景观仍未完全理解，种族特异性变异和多基因风险因素尚待充分阐明。

5-甲基胞嘧啶（m⁵C）是RNA的一种关键表观遗传修饰，主要由甲基转移酶如NSUN家族和tRNA二甲基转移酶1（TRDMT1）酶催化。这种修饰涉及在RNA分子的胞嘧啶残基的第五个碳原子（C5）上添加一个甲基（-CH₃）。m⁵C修饰增强RNA稳定性，通过影响核糖体结合效率调节蛋白质合成，促进RNA从细胞核到细胞质的运输，并参与细胞对环境变化（如氧化应激和热休克）的响应。

先前的研究表明，m⁵C相关基因的多态性与神经母细胞瘤风险显著相关。具体而言，TET1基因中的rs3998860 G>A和rs12781492 A>C、TET2基因中的rs10007915 G>C和rs7670522 A>C、TET3基因中的rs828867 G>A以及NSUN2基因中的rs13181449 C>T多态性已被识别为与神经母细胞瘤易感性密切相关。这些遗传多态性可能影响m⁵C修饰水平，从而调节基因表达，并 contribute 于神经母细胞瘤的发生和发展。

作为m⁵C修饰的关键酶，TRDMT1基因（也称为DNMT2）在维持RNA甲基化的动态平衡中扮演 crucial 角色。TRDMT1主要催化tRNA的m⁵C修饰，并通过调节RNA稳定性、易位和功能，在细胞应激响应和基因表达调控中发挥重要作用。研究表明，TRDMT1功能障碍与多种疾病的发展密切相关，包括代谢紊乱、病毒感染和某些类型的癌症。特别是在肝细胞癌中，DNMT2通过抑制促凋亡基因TNFSF10促进肿瘤进展并增强硼替佐米耐药性；在结直肠癌中，TRDMT1调节的tRNA片段tRF-3022b调节凋亡和M2巨噬细胞极化。临床上，TRDMT1已成为一个有前景的抗癌靶点，最近的研究识别出小分子抑制剂，可 disrupt 其m⁵C甲基化活性并抑制肿瘤生长。鉴于其在m⁵C修饰和肿瘤发生中的关键作用，研究TRDMT1基因多态性在神经母细胞瘤中的作用可能有助于阐明其对肿瘤易感性的贡献。

材料与方法

研究受试者

本研究经南京医科大学附属儿童医院机构审查委员会批准（批准号：202112141-1）。最初，从中国江苏省南京医科大学附属儿童医院招募了402名神经母细胞瘤患者和473名对照。人口统计学特征，包括年龄、性别和肿瘤部位，在表S1中提供。病例和对照组在年龄或性别分布上没有显著差异（p > 0.05）。所有参与者签署了知情同意书，并同意参与研究。

SNP选择和基因分型

在本研究中，选择了三个TRDMT1 SNP（rs7074891 T>C、rs10904887 T>C和rs2273734 C>T）进行分析。基因分型按照团队先前发表的方法进行。这些SNP可能影响miRNA结合位点、影响RNA剪接，并调节基因表达水平，如SNPinfo所预测。从对照组和诊断为神经母细胞瘤的儿童的外周血样本中提取基因组DNA，使用TIANamp基因组DNA试剂盒。随后使用TaqMan Genotyping PCR PreMix对TRDMT1基因SNP进行基因分型。为确保基因分型的准确性，随机选择10%的样本进行重复测试，结果显示出100%的一致性。

统计分析

在本研究中，使用卡方检验和t检验评估神经母细胞瘤患者和对照组之间的显著差异。使用拟合优度卡方检验评估对照组中每个SNP的Hardy-Weinberg平衡（HWE）。使用非条件逻辑回归分析TRDMT1基因SNP与神经母细胞瘤风险之间的关联，并调整年龄和性别后的 odds ratios（ORs）和95%置信区间（CIs）。使用Genotype-Tissue Expression（GTEx）项目的数据评估SNP与基因表达之间的相关性。此外，从R2平台获取神经母细胞瘤数据集GSE49710和GSE45547。通过R2平台进行生存分析，以评估TRDMT1表达对神经母细胞瘤预后的影响。生成Kaplan-Meier生存曲线，比较不同TRDMT1表达水平组的生存结果，并使用对数秩检验评估统计显著性。进行临床相关性分析，以检查TRDMT1表达水平与临床特征之间的关联，包括年龄、性别、MYCN扩增状态、儿童肿瘤学组（COG）风险分类和国际神经母细胞瘤分期系统（INSS）分期。使用卡方检验比较高表达组和低表达组之间的差异，统计显著性设定为p < 0.05。使用R（版本4.4.2）和ggplot2包进行数据可视化。

结果

TRDMT1多态性与神经母细胞瘤风险相关

在402名神经母细胞瘤患者和473名对照中，成功对394名神经母细胞瘤患者和473名对照样本进行了TRDMT1基因的基因分型。三个TRDMT1 SNP的基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡（HWE，rs7074891 T>C的p = 0.927，rs10904887 T>C的p = 0.818，rs2273734 C>T的p = 0.594；表1）。rs7074891 T>C变异在TC基因型中与神经母细胞瘤风险降低显著相关（TC vs. TT：调整后OR = 0.69，95% CI = 0.52–0.92，p = 0.012）。在显性模型（TC/CC vs. TT）中，TT和TC基因型的组合分析也揭示了与疾病风险降低的显著关联（调整后OR = 0.75，95% CI = 0.57–0.98，p = 0.036）。对于rs10904887 T>C变异，CC基因型与神经母细胞瘤风险增加显著相关（CC vs. TT：调整后OR = 1.53，95% CI = 1.06–2.20，p = 0.023）。根据隐性模型（CC vs. TC/TT），CC基因型携带者显著增加神经母细胞瘤风险（调整后OR = 1.73，95% CI = 1.27–2.38，p = 0.0006）。此外，rs2273734 C>T变异显示TT基因型与神经母细胞瘤风险增加显著相关（TT vs. CC：调整后OR = 1.72，95% CI = 1.03–2.87；p = 0.040）。在隐性模型（TT vs. CC/CT）中，TT基因型也与显著更高的疾病风险相关（调整后OR = 1.80，95% CI = 1.09–2.97，p = 0.023）。组合风险基因型分析显示，携带1-3个风险基因型的个体与携带0个风险基因型的个体相比，疾病风险显著增加（调整后OR = 1.81，95% CI = 1.38–2.37，p < 0.0001），表明这些SNP对疾病易感性具有累积效应。

TRDMT1基因型和神经母细胞瘤易感性的分层分析

我们进一步分析了rs7074891、rs10904887和rs2273734基因型与神经母细胞瘤风险在按年龄、性别、起源部位和临床分期分层的亚组中的关联（表2）。分层分析显示，rs7074891 TC/CC基因型在年龄≤18个月的儿童（调整后OR = 0.61，95% CI = 0.38–0.98，p = 0.039）和肿瘤起源于纵隔的儿童（调整后OR = 0.59，95% CI = 0.39–0.89，p = 0.013）中与神经母细胞瘤风险降低显著相关。对于携带rs10904887 CC基因型的个体，几个亚组与神经母细胞瘤风险增加显著相关：年龄>18个月的儿童（调整后OR = 1.72，95% CI = 1.17–2.54，p = 0.006）、男性（调整后OR = 2.30，95% CI = 1.50–3.55，p = 0.0002）、肿瘤起源于肾上腺（调整后OR = 1.97，95% CI = 1.21–3.22，p = 0.007）和腹膜后区域的肿瘤（调整后OR = 1.77，95% CI = 1.18–2.65，p = 0.006）。此外，携带rs10904887 CC基因型的个体无论临床分期如何，均呈现更高的神经母细胞瘤风险，无论是在早期（I + II + 4s：调整后OR = 1.98，95% CI = 1.33–2.94，p = 0.0008）还是晚期患者（III + IV：调整后OR = 1.62，95% CI = 1.08–2.45，p = 0.021）。对于rs2273734 TT基因型，风险增加与以下亚组显著相关：女性（调整后OR = 2.21，95% CI = 1.06–4.63，p = 0.035）、肿瘤起源于纵隔（调整后OR = 2.95，95% CI = 1.57–5.55，p = 0.0008）和早期临床分期患者（I + II + 4s：调整后OR = 1.98，95% CI = 1.07–3.65，p = 0.030）。

跨亚组的组合风险基因型和神经母细胞瘤易感性

分层分析表明，携带1-3个风险基因型与 various 亚组中神经母细胞瘤风险增加显著相关（表3）。对于年龄≤18个月的儿童，调整后的 odds ratio（AOR）为1.75（95% CI = 1.08–2.84，p = 0.023），而对于年龄>18个月的儿童，风险略高（AOR = 1.83，95% CI = 1.31–2.54，p = 0.0004）。男性呈现更高的神经母细胞瘤风险（AOR = 2.02，95% CI = 1.38–2.94，p = 0.0003） than 女性（AOR = 1.60，95% CI = 1.08–2.38，p = 0.019）。就肿瘤起源而言，肿瘤位于纵隔的个体风险最高（AOR = 2.05，95% CI = 1.36–3.09，p = 0.0006），其次是肾上腺肿瘤（AOR = 1.79，95% CI = 1.14–2.79，p = 0.011）和腹膜后肿瘤（AOR = 1.71，95% CI = 1.19–2.45，p = 0.003）。此外，携带1-3个风险基因型的临床分期I + II + 4s患者风险显著增加（AOR = 1.90，95% CI = 1.33–2.71，p = 0.0004），III + IV期患者也是如此（AOR = 1.56，95% CI = 1.08–2.23，p = 0.017）。总体而言，我们的研究结果表明，携带1-3个风险基因型 consistently 与不同亚组中神经母细胞瘤风险增加相关，且在性别、肿瘤起源和临床分期方面存在显著 variations。

TRDMT1多态性与基因表达的相关性

为探索TRDMT1多态性对基因表达的影响，我们使用GTEx数据库进行了表达数量性状位点（eQTL）分析。结果表明，rs7074891 C等位基因与胫神经（p = 2.2 × 10^?5，图1A）和阳光暴露皮肤（小腿）（p = 7.98 × 10^?5，图1B）中TRDMT1表达增加显著相关。类似地，rs10904887 C等位基因与肾上腺（p = 5.57 × 10^?10，图1C）和胫神经（p = 7.98 × 10^?13，图1D）中TRDMT1表达增加显著相关。相反，rs2273734 T等位基因与肾上腺（p = 2.62 × 10^?10，图1E）和胫神经（p = 8.5 × 10^?22，图1F）中TRDMT1表达降低显著相关。这些发现表明，TRDMT1多态性对基因表达施加组织特异性调节 effects，这可能 contribute 于神经母细胞瘤易感性和进展。

TRDMT1与临床特征和预后的关联

正常肾上腺组织中的TRDMT1表达水平显著低于神经母细胞瘤组织（图2A）。临床相关性分析显示，在GSE49710和GSE45547数据集中，不同INSS分期间TRDMT1表达水平存在显著差异，在INSS III + IV期观察到更高表达（图2B,C）。生存分析表明，高TRDMT1表达与较差的总体生存（OS）和无事件生存（EFS）显著相关（图2D,E）， suggesting TRDMT1可能作为 adverse 结局的潜在预后生物标志物。进一步分析显示，TRDMT1表达与MYCN扩增状态显著相关，在MYCN扩增组中观察到比非扩增组更高的表达（图2F）。此外，TRDMT1表达在高危COG组中显著高于低危组（图2G）。总之，这些发现表明，异常高的TRDMT1表达可能在神经母细胞瘤的发展和进展中扮演 critical 角色。其与肿瘤分期、预后和风险分层的强关联支持其作为神经母细胞瘤诊断或预后生物标志物的潜力。

讨论

神经母细胞瘤是一种高度异质性的儿科恶性肿瘤，受遗传 predisposition 和表观遗传调控的影响。在RNA修饰中，m⁵C已成为肿瘤发展中的关键参与者。TRDMT1，一种关键的m⁵C甲基转移酶，已被 implicated 于癌症进展，但其在神经母细胞瘤中的作用仍未定义。

在本研究中，我们识别了中国儿科人群中TRDMT1基因多态性（rs7074891 T>C、rs10904887 T>C和rs2273734 C>T）与神经母细胞瘤易感性之间的关联。值得注意的是，rs7074891 TC基因型 appeared 保护性，而rs10904887 CC和rs2273734 TT基因型 conferred elevated 风险。这些关联得到分层和组合风险基因型分析的进一步支持， suggesting TRDMT1遗传变异可能 contribute 于神经母细胞瘤风险的个体差异。

异常m⁵C修饰及其相关酶的失调 increasingly 与肿瘤发生相关， primarily 通过影响RNA甲基化、转录稳定性和基因表达。NSUN和TET家族的成员在此背景下已被广泛研究。例如，NSUN2促进胃癌和膀胱癌进展，其多态性rs13181449 C>T通过 diminished NSUN2表达和 lower m⁵C水平与神经母细胞瘤易感性降低相关。类似地，TET1-3多态性通过非催化机制维持干性和细胞可塑性与神经母细胞瘤风险相关。

TRDMT1催化tRNA反密码环中胞嘧啶38的m⁵C修饰， contribute 于RNA稳定性、翻译准确性和细胞 homeostasis。其在肝细胞癌和结直肠癌中的 overexpression 与肿瘤进展和不良预后相关，且多态性rs34434809 G>C可能导致肝细胞癌更差 outcomes。然而，TRDMT1及其多态性在神经母细胞瘤中的 precise 作用仍未探索。

我们首次证明TRDMT1 SNP与神经母细胞瘤易感性显著相关。rs7074891 TC基因型 provided 针对神经母细胞瘤的保护 effects， particularly 在18个月以下的儿童和肿瘤起源于纵隔的儿童中。相反，rs10904887 CC和rs2273734 TT基因型与 older 儿童和肾上腺或腹膜后区域肿瘤患者的风险增加相关。这些跨年龄、性别和肿瘤起源的异质 effects 表明，TRDMT1 SNP的 penetrance 可能取决于宿主和肿瘤背景，与遗传变异 effects 可能因组织或发育状态而异的发现一致。

组合风险基因型的进一步分析显示，携带1-3个风险基因型的个体在大多数亚组中神经母细胞瘤风险显著增加。值得注意的是，效应在男性、肾上腺或纵隔肿瘤起源患者以及晚期临床分期患者中更为 pronounced。这些发现表明，多个风险基因型对疾病易感性具有累积 impact，在特定宿主背景或不同肿瘤特征中效应更强。

eQTL分析显示，这些SNP影响 various 组织中的TRDMT1表达，包括肾上腺、胫神经和皮肤。值得注意的是，rs7074891 C和rs10904887 C等位基因与TRDMT1表达增加相关，而rs2273734 T等位基因与表达降低相关。这些发现表明，不同等位基因可能通过增加或减少TRDMT1活性调节神经母细胞瘤风险。组合风险基因型的累积效应进一步支持这些等位基因在疾病易感性中的 critical 调节作用，与先前强调多 locus 遗传变异对癌症风险 impact 的报告一致。

生存分析证实， elevated TRDMT1表达与神经母细胞瘤患者较差预后相关。此外， increased TRDMT1表达与 critical 临床特征如MYCN扩增和INSS分期相关， suggesting 其在肿瘤进展中的作用。这些发现 collectively 表明，TRDMT1可能在神经母细胞瘤进展中扮演 oncogenic 角色，并支持其作为侵袭性疾病的生物标志物的 utility。

总体而言，我们的研究结果识别了m⁵C关键基因TRDMT1多态性与神经母细胞瘤易感性、预后和临床特征之间的关联。通过 comprehensive 分析，包括分层分析、组合风险基因型分析、eQTL分析、生存分析和临床相关性分析，我们的研究结果 highlight TRDMT1作为神经母细胞瘤风险评估和 therapeutic 靶点的潜在标志物。然而，该研究受其相对较小的样本量和缺乏独立队列验证的限制，这可能 reduce 观察到的关联的 generalisability。需要更大数据集的未来研究来验证这些发现，并进一步研究这些多态性的 specific 功能机制，包括它们对m⁵C水平、TRDMT1酶活性和下游RNA稳定性的 effects。

结论

我们的研究揭示了TRDMT1基因多态性（rs7074891 T>C、rs10904887 T>C和rs2273734 C>T）与神经母细胞瘤易感性之间的显著关联。这些结果表明，TRDMT1可能作为神经母细胞瘤风险评估和预后的分子标志物。