新型黏附性口服给药系统：β-环糊精复合制剂的抗真菌活性、细胞相容性与伤口愈合潜力研究

　　本研究开发了基于β-环糊精（βCD）复合制剂的黏膜黏附性凝胶，负载制霉菌素（NYS）或氯己定（CHX），展现出显著抗白色念珠菌活性（p<0.05）、优异细胞相容性（LDH释放降低、凋亡率无差异）和促愈合特性（完全伤口闭合、抗炎基因下调、ROS清除能力增强），其黏膜黏附性显著优于市售咪康唑凝胶（DK），为口腔念珠菌病治疗提供新策略。

　　

2 材料与方法

3 结果与讨论

3.1 浸提液细胞相容性浓度的确定

通过L929小鼠成纤维细胞毒性筛查实验，确定了各黏膜黏附制剂浸提液的安全浓度范围。空白凝胶（GEL）在未稀释时仅显示约50%抑制率，而市售咪康唑凝胶（DK）在浓度≥25%时完全致死。非复合制霉菌素（NYS）制剂在100%-25%浓度范围内呈现剂量依赖性抑制，但低浓度时无害。值得注意的是，βCD复合的NYS制剂（NYS:βCD）在所有测试浓度下均无有害效应，未稀释浸提液细胞活性仍保持75%以上，超过ISO 10993标准规定的70%细胞毒性阈值。氯己定（CHX）制剂毒性较高，在≥25%浓度时致死，在≤12.5%浓度范围内显示剂量依赖性抑制效应。

3.2 黏膜黏附浸提液的抗真菌活性

通过微稀释法评估了浸提液对白色念珠菌（Candida albicans）的抗真菌活性。GEL和DK浸提液未显示抗真菌效果。所有含NYS或CHX的制剂（无论是否复合βCD）均显著降低白色念珠菌代谢活性（p<0.05）。NYS制剂在测试浓度下显示完全抑制，CHX制剂中，CHX 4.8在浓度≤6.25%时显示强抗真菌活性，CHX 32在浓度≤1.56%时几乎完全抑制。特别重要的是，复合CHX:βCD在较低浓度（3.12%和1.56%）下比含相同剂量非复合药物的黏膜黏附剂（CHX 4.8 mg/g）显示出更显著的真菌代谢活性降低。

3.3 黏膜黏附浸提液的细胞相容性

基于前期筛选结果，选择特定浓度范围（NYS制剂25%-6.25%，CHX制剂6.25%-1.56%）评估浸提液对人牙龈成纤维细胞（HGFs）的细胞相容性。MTT检测显示，GEL和NYS组浸提液培养的HGF代谢活性接近100%，与对照组无显著差异。CHX组中仅在CHX:βCD浸提液6.25%浓度时观察到代谢活性降低。DK浸提液在较高浓度（25%、12.5%和6.25%）显示抑制效应。

细胞形态学观察显示，对照组细胞呈现明显的细胞核、良好组织的F-肌动蛋白纤维、大量细胞质延伸和强烈的核周线粒体分布。暴露于空白凝胶（GEL）或低浓度NYS（NYS 16.1和NYS:βCD）浸提液的HGFs形态与对照组无区别。NYS 32组出现细胞质体积减少的形态学变化，DK组在整个评估时间内细胞数量减少，细胞间连接减少。CHX组中，仅CHX 32处理的HGFs显示细胞质体积减少的形态学变化。

乳酸脱氢酶（LDH）释放检测显示，与阴性对照相比，DK在25%浓度时引起LDH释放轻微增加，而所有实验组（GEL、NYS和CHX）浸提液孵育后的LDH释放值显著降低。细胞凋亡检测显示，含NYS或CHX的黏膜黏附浸提液对HGFs的凋亡效应不显著，与GEL组相当（p>0.05）。

3.4 黏膜黏附剂的愈合特性

通过划痕实验评估HGFs在NYS（25%）和CHX（3.25%）浸提液中的迁移活性。所有组别在24小时均观察到细胞迁移，但DK组的伤口闭合率显著低于其他实验组和对照组（p<0.05）。48小时后，除DK组外所有组别均实现完全伤口闭合（p<0.05）。

通过qPCR分析LPS刺激的HGFs中促炎基因（IL1B、IL6、CXCL8和NFKB）的表达。LPS刺激导致所有评估基因表达显著增加（p<0.05）。GEL和NYS:βCD组浸提液处理显示这些基因表达明显减少（p>0.05）。CHX:βCD浸提液处理导致大多数炎症基因表达下调（p>0.05），但IL1B除外。DK组浸提液处理后未观察到这些基因表达的显著减少。

DPPH法评估黏膜黏附凝胶的ROS清除活性。GEL、NYS:βCD、CHX 4.8和CHX:βCD组在0-2小时期间显示稳定ROS百分比显著降低（p<0.05）。GEL、NYS 16.1、NYS:βCD和CHX:βCD组在0-4小时期间数值显著降低（p<0.05）。大多数ROS中和发生在前2小时，表明快速清除活性。DK或CHX 32组未检测到ROS减少。

3.5 黏膜黏附特性

质地分析显示，在黏附性方面，各组间与空白凝胶（GEL组）相比无显著差异，表明复合和非复合药物的加入未改变凝胶的黏膜黏附特性。黏附功和脱粘距离结果显示，与GEL组相比，βCD复合药物组无差异，表明包含复合物在凝胶中分散均匀，不影响其黏膜黏附性能。

DK和CHX 32组的黏附功值显著较低（p<0.05），表明黏膜黏附性能降低。相反，NYS 16.1和CHX:βCD组显示显著较高的黏附功（p<0.05），CHX:βCD在所有CHX制剂中表现突出，强化了βCD对黏膜黏附的积极影响。脱粘距离方面，CHX 32组是唯一显示比GEL组数值显著更低的制剂（p<0.05），表明在较高药物浓度未复合时黏膜黏附保留受损。相比之下，NYS:βCD和CHX:βCD组保持了与对照组相当的脱粘距离。

4 结论

基于本研究结果，含有βCD-NYS或CHX复合物的新型黏膜黏附制剂在体外表现出黏膜黏附性、抗真菌活性、细胞相容性、抗炎和愈合潜力。NYS:βCD浸提液显示出改善的细胞相容性，而CHX:βCD在相同浓度下比非复合载体表现出增强的抗真菌活性。

研究结果突出了所提出制剂作为口腔念珠菌病局部治疗替代方案的潜力，证明了其效力和耐受性。为推进临床应用，需要进行体内研究以验证这些制剂在口腔念珠菌病患者中的临床疗效、长期安全性、适当剂量和应用方案。