CAPG通过TGFB1/Smad/Nrf2信号通路调控肝细胞癌多柔比星耐药性的机制研究及其临床意义

　　本研究深入探讨了细胞骨架相关蛋白G（CAPG）在肝细胞癌（HCC）中的表达、临床意义及其介导多柔比星（Dox）耐药的分子机制。通过生物信息学、免疫组化、细胞实验及动物模型，发现CAPG在HCC中显著上调，与不良预后相关，并通过调控铁死亡（ferroptosis）及TGFB1/Smad2/NRF2信号通路影响Dox耐药性。CAPG knockdown可逆转耐药，抑制肿瘤生长，为HCC预后评估及联合治疗提供了新靶点。

　　

1 引言

肝细胞癌（HCC）是全球最常见且致死率高的恶性肿瘤之一，由于化疗耐药等问题，患者预后较差。多柔比星（Dox）是常用化疗药物，但耐药性严重限制了其疗效。铁死亡（ferroptosis）作为一种铁依赖性细胞死亡形式，与脂质过氧化和活性氧（ROS）积累相关，为逆转化疗耐药提供了新思路。细胞骨架相关蛋白G（CAPG）在多种癌症（如胃癌、乳腺癌、结直肠癌等）中异常表达，与肿瘤侵袭和转移相关，但其在HCC中的作用及与Dox耐药的关系尚不明确。本研究旨在揭示CAPG在HCC进展和化疗耐药中的具体作用机制。

2 材料与方法

研究利用Xiantao平台、TCGA数据库和Kaplan-Meier Plotter进行生物信息学分析，包括CAPG表达差异、生存分析和基因富集分析（GSEA）。细胞实验采用HepG2、Hep3B及其Dox耐药株（HepG2/Dox、Hep3B/Dox），通过慢病毒转染实现CAPG knockdown或过表达，采用MTT法、Western blot、EdU染色、Transwell实验评估细胞活力、增殖、迁移和侵袭。铁死亡相关指标（GSH、MDA、铁离子浓度）使用商用试剂盒检测。动物实验采用BALB/c裸鼠模型，皮下接种肿瘤细胞，观察肿瘤生长和重量变化。

3 结果

3.1 CAPG被鉴定为与Dox耐药、HCC预后和铁死亡相关的关键基因

通过GSE54175和GSE125180数据集分析，筛选出8个与Dox耐药、预后和铁死亡相关的交集基因，CAPG是其中之一。单因素和多因素回归分析显示，CAPG高表达与不良预后显著相关（HR=1.98, p<0.001）。

3.2 CAPG在HCC标本和细胞系中显著高表达

TCGA数据分析显示，CAPG在HCC组织中表达显著高于正常组织（p<0.001）。Western blot验证4对临床样本，HCC组织中CAPG表达上调（p<0.01）。在SNU-398、HepG2、SNU-475和Hep3B细胞系中，CAPG表达均高于正常肝细胞L02（p<0.01）。

3.3 CAPG促进肝癌细胞的耐药性

Dox耐药细胞系HepG2/Dox和Hep3B/Dox中CAPG表达显著高于亲本细胞（p<0.01）。MTT实验显示，CAPG knockdown降低耐药细胞活力，而过表达促进耐药。

3.4 CAPG与HCC患者不良总生存期相关

Kaplan-Meier分析表明，CAPG高表达与较差的总生存期相关（p<0.001）。亚组分析显示，在白人、男性、年龄>60岁和T3期患者中，CAPG高表达均与不良预后相关。

3.5 CAPG对HCC诊断具有高准确性

ROC曲线分析显示，CAPG诊断HCC的AUC为0.800（CI=0.742–0.858），表明其作为诊断标志物的潜力。时间依赖性ROC显示，1年、3年和5年AUC分别为0.632、0.602和0.675。

3.6 CAPG knockdown克服HCC细胞对Dox的耐药性

CAPG knockdown显著降低HepG2/Dox和Hep3B/Dox细胞活力（p<0.01），并降低Dox的IC50。过表达CAPG促进SNU-398和SNU-475细胞增殖、迁移和侵袭。

3.7 GO/KEGG分析和GSEA分析

GO/KEGG分析显示CAPG与被动跨膜转运体活性、通道活性和铁离子结合相关。GSEA提示CAPG与脂肪酸代谢、铁死亡、离子通道转运、NRF2通路等功能相关。

3.8 CAPG knockdown通过erastin和Dox促进铁死亡

CAPG knockdown增强erastin和Dox诱导的铁死亡，表现为GSH水平下降、MDA和铁离子浓度升高（p<0.05）。过表达CAPG则抑制这些效应。

3.9 CAPG knockdown通过TGFB1/Smad/Nrf2信号通路增加铁死亡

Spearman分析显示CAPG与TGFB1、Smad2/3呈正相关（R=0.587）。Western blot证实CAPG knockdown降低TGFB1、p-Smad2/3和Nrf2表达，而过表达则上调这些蛋白。

3.10 CAPG促进裸鼠肿瘤进展

体内实验显示，过表达CAPG促进SNU-475细胞在裸鼠中的肿瘤生长（p<0.01），而CAPG knockdown联合Dox治疗显著抑制肿瘤体积和重量（p<0.001）。

4 讨论

本研究系统阐述了CAPG在HCC中的高表达及其与不良预后的关系，并首次揭示CAPG通过调控TGFB1/Smad/Nrf2信号通路和铁死亡介导Dox耐药。CAPG knockdown可逆转耐药性，抑制肿瘤生长，为HCC治疗提供了新的生物标志物和联合治疗靶点。然而，临床样本量较小和动物模型异质性限制了结果的普适性，未来需扩大样本量并探索更精确的体内模型。