重组宿主防御肽结构-抗菌活性关系研究：对抗耐药菌的新策略与机制解析

　　本刊推荐：这篇研究深入探讨了重组宿主防御肽（HDPs）的结构-活性关系（SAR），针对耐药革兰氏阳性菌（如MRSA、MRSE）和革兰氏阴性菌（如MDR Pseudomonas aeruginosa）展开系统性分析。研究创新性地提出基于pH和结构依赖性的脂溶性和两亲性计算模型，揭示了两亲性（amphipathicity）对抗革兰氏阳性菌活性的主导作用，以及丝氨酸/苏氨酸暴露面积对抗革兰氏阴性菌活性的影响。此外，研究还发现多结构域蛋白中HDPs的排列顺序及结构域间相互作用（如分子对接评分）对生物活性具有决定性作用，为理性设计新型抗菌肽提供了重要理论依据和实践策略。

　　

引言

抗菌肽（AMPs）作为一类具有潜力的抗菌剂，能够应对日益严重的抗菌药物耐药性（AMR）问题。宿主防御肽（HDPs）如LL37和防御素（defensins）表现出广谱抗菌活性，其作用机制主要涉及破坏微生物膜或干扰关键细胞过程。近年来，借助重组技术生产HDPs取得显著进展，类似胰岛素的生产历程，HDPs正逐步实现重组规模化生产，并在抗病原微生物方面展示出显著效果。

HDPs的生物活性与其三维结构和多样化的理化性质密切相关，包括阳离子性、脂溶性和两亲性等。阳离子性有助于与带负电的微生物膜相互作用，脂溶性和两亲性则影响肽与膜的结合与插入能力。尽管已有大量研究关注这些性质与活性的关系，但定量模型和相关性分析仍不够完善，尤其是在考虑肽的结构背景和局部环境时。因此，本研究旨在利用最先进的脂溶性和两亲性计算模型，结合实验数据，全面分析重组HDPs的结构-抗菌活性关系。

材料与方法

计算部分

本研究采用ColabFold Server结合MMseqs2和AlphaFold2对第一代和第二代抗菌肽进行结构建模。脂溶性计算分别基于序列（GRAVY和ProtL尺度）和结构背景（context-dependent），使用ProtL尺度并引入校正因子α和γ，分别处理分子内氢键（IMHB）和盐桥（IMSB）的影响。两亲性计算则通过区分亲水和疏水面，利用结构背景依赖的脂溶性值进行加权求和。

分子对接研究采用基于3D Zernike描述符的蛋白对接方法，评估HDP结构域间的相互作用，使用GOAP、DFIRE、ITScore和Rank Sum等多种评分标准。

实验部分

第一代抗菌肽将HβD2、HβD3、LAP、HD5和LL37与绿色荧光蛋白（GFP）通过连接序列融合，并添加C端6组氨酸标签（H6-tag）。第二代多结构域蛋白直接组合多个HDPs，如HD5-LL37-HβD3、HD5-LL37-HD5-LL37和HD5-LAP-LL37-HβD3。蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中表达，经IPTG诱导后通过IMAC纯化。

抗菌活性测试针对甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌（MSSA）、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）、耐甲氧西林表皮葡萄球菌（MRSE）和铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）进行，包括广泛筛选杀菌实验和最小抑菌浓度（MIC）测定。溶血活性实验则使用牛红细胞评估肽的毒性。

结果

第一代抗菌肽的理化性质

所有五种第一代抗菌肽在pH=7.4时均带正电，有利于与细菌膜相互作用。序列基础的脂溶性计算（GRAVY和平均序列logD_7.4）表明HDPs整体亲水，尤其是HβD3和LL37。而结构背景依赖的脂溶性计算显示HβD3和LAP高度亲水，HD5、HβD2和LL37则较为疏水，其中LL37因丰富的IMHB和IMSB而疏水性最高。

两亲性计算针对具有明确亲疏水面的结构域进行，结果显示HD5和HβD3两亲性最高，LAP和HβD2次之，LL37最低。结构背景的引入显著降低LL37的两亲性值，印证了IMHB和IMSB对极性中和的影响。

抗革兰氏阳性菌的构效关系

针对MSSA、MRSA和MRSE，HβD3重组肽的抗菌活性最强，其次是HD5、HβD2、LAP，LL37最弱。结构背景依赖的脂溶性和两亲性与抗菌活性（cfu减少和MIC）呈良好相关性：亲水性和两亲性越高，抗革兰氏阳性菌活性越强。序列基础的计算方法则无法得出类似相关性。

抗革兰氏阴性菌的构效关系

对于MDR铜绿假单胞菌，所有第一代肽均具有一定杀菌活性，但LL37效果有限。脂溶性和两亲性不能完全解释其活性差异。进一步分析发现， amphipathic区域中丝氨酸（Ser）和苏氨酸（Thr）的数量和溶剂可及表面积（SASA）与抗革兰氏阴性菌活性密切相关：HD5含有最多Ser/Thr且暴露面积大，活性最强；LL37和HβD3相关残基较少，活性较弱。加权SASA后的数量（n_SASA）与MIC呈指数衰减关系，拟合优度更高。

溶血活性

两亲性最高的HβD3在低浓度（2.5μM）下即显示溶血活性，而两亲性最低的LL37在10μM时仍无溶血现象。该结果进一步验证了结构背景依赖的脂溶性和两亲性计算模型的准确性。

第二代抗菌肽的构效关系

第二代多结构域蛋白的设计结合了抗革兰氏阳性菌活性高的HDPs（如HβD3、HD5）和抗革兰氏阴性菌活性高的HD5，并穿插低两亲性域（如LL37、LAP）以平衡毒性。活性测试表明，HD5-LL37-HD5-LL37（交替高/低两亲性域）对革兰氏阳性和阴性菌均表现出优异活性，而HD5-LAP-LL37-HβD3（非交替）活性显著降低。

分子对接显示，HD5与LL37间相互作用较弱（评分接近参考值），有利于结构域保持生物活性；而LAP与LL37间相互作用较强（评分高40%），可能导致结构域互作而降低活性。此外，抗革兰氏阳性菌活性还依赖于高活性域（如HD5）位于多肽末端，以充分暴露其amphipathic区域；而对于革兰氏阴性菌，只要HD5存在即可保持活性。

协同效应比较

HD5-LL37-HD5-LL37多域蛋白与相应单独肽混合物的MIC相近（3.75μM），且低于各域MIC的算术平均值（4.63μM），显示协同效应。而HD5-LAP-LL37-HβD3多域蛋白活性（MIC=7.50μM）高于其混合物（MIC=15.00μM），但远高于算术平均值（3.72μM），协同效应消失，与LAP-LL37间强相互作用有关。

讨论与结论

本研究通过整合结构背景依赖的理化性质计算、分子对接和实验验证，成功揭示了重组HDPs的构效关系。对于第一代肽，两亲性是抗革兰氏阳性菌活性的主要决定因素，而Ser/Thr暴露面积则主导抗革兰氏阴性菌活性。对于第二代多域蛋白，交替高/低两亲性域的排列、弱域间相互作用以及高活性域的末端位置是保持活性的关键。

这些发现不仅为理性设计新型抗菌肽提供了深入见解和实用策略，而且提出的计算模型和结构描述符可进一步融入人工智能（AI）算法，用于从蛋白质组中挖掘和优化新型抗菌肽序列，以应对多重耐药菌的威胁。