铜绿假单胞菌ClpP1•ClpP2异源复合物的结构解析及其与AAA+ ClpX解折叠酶的互作机制研究

　　本综述通过冷冻电镜技术首次揭示了铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）中ClpX•ClpP1•ClpP2蛋白酶体的高分辨率结构，阐明了ClpP2仅在异源复合物中激活的分子机制，及其在细菌应激响应和致病性调控中的关键作用，为针对耐药菌感染的新型抑制剂设计提供了结构基础。

　　

引言

AAA+蛋白酶在多种生物体中执行关键调控功能，通过降解错误折叠蛋白和调控蛋白维持细胞内蛋白质稳态（proteostasis）。在铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）中，ClpXP蛋白酶由AAA+ ATP酶ClpX和自 compartmentalized 肽酶ClpP组成，其中ClpP存在两种旁系同源物^PaClpP1和^PaClpP2，它们可组装成同源（^PaClpP1•ClpP1）或异源（^PaClpP1•ClpP2）复合物。值得注意的是，^PaClpP2仅在异源复合物中才具有蛋白酶活性。铜绿假单胞菌是免疫缺陷患者和囊性纤维化患者的主要致病菌，其ClpXP系统通过调控毒力因子表达和生物膜形成参与感染过程，因此成为抗菌药物开发的重要靶标。

结果与讨论

复合物制备与结构解析

研究人员通过染色体C端FLAG标签标记的^PaClpP2蛋白，从静止期铜绿假单胞菌PAO1菌株中内源性纯化出天然^PaClpP1•ClpP2复合物。为增强冷冻电镜分析中的颗粒对齐精度，在制样前加入过量纯化的^PaClpX蛋白作为基准标记。最终获得2.9 ?分辨率的^PaClpX•ClpP1•ClpP2复合物冷冻电镜结构（EMDB-49274，PDB 9NDJ），并通过信号减法得到3.4 ?的^PaClpX局部结构。

结构特征与机制启示

结构分析显示，^PaClpX六聚体通过其IGF环（Ile²⁶⁸-Gly²⁶⁹-Phe²⁷⁰）与^PaClpP1七聚体的疏水裂隙结合，但亚基D与E之间的裂隙保持空置状态。与此相反，^PaClpP2的裂隙被C端螺旋结构阻塞，且结合位点残基的化学特性差异共同阻止了^PaClpX与^PaClpP2的直接结合。

轴向门户构象差异

^PaClpP1的N端β-发夹结构（残基4-20）呈外向构象，形成开放的轴向门户，允许底物多肽进入降解腔室。而^PaClpP2的对应区域（残基14-20）形成α螺旋，阻塞了轴向门户。这表明在异源复合物中，底物可能仅通过^PaClpP1门户进入，而产物出口可能通过未结合的IGF裂隙或环-环界面瞬时开口实现。

激活机制与催化调控

与单独^PaClpP2的晶体结构比较发现，^PaClpP1结合诱导了^PaClpP2手柄区域（残基123-148）的构象变化，通过疏水和静电相互作用稳定了催化三联体（Ser⁹⁸-His¹²³-Asp¹⁷²）的活性构象。在游离^PaClpP2中，催化残基间距较大且构象异质性较高，而异源复合物中结构均一性显著提升。虽然D172与H123间距（~5?）略大于经典催化三联体距离，这可能暗示水分子介导的催化机制或底物诱导的构象调整。

底物特异性调控因素

^PaClpX•ClpP1•ClpP1偏好切割丙氨酸和甘氨酸后位点，而异源复合物更倾向亮氨酸后位点切割。这种差异源于：第一，活性位点附近残基的化学特性差异；第二，^PaClpP2的N端13个残基（实验验证存在但结构无序）伸入降解腔室，可能通过与底物相互作用影响切割特异性。AlphaFold预测显示该区域呈无序构象，且序列保守性低。

材料与方法

蛋白纯化与鉴定

^PaClpX在大肠杆菌中重组表达并纯化。^PaClpP1•ClpP2复合物从FLAG标记的铜绿假单胞菌株中内源性纯化，通过尺寸排阻色谱分离。Edman降解验证了^PaClpP2 N端序列的完整性。

冷冻电镜分析

样品在2.5 mM ATP存在条件下制备，采用Quantifoil铜网进行玻璃化冷冻。数据在Titan Krios G3i显微镜上收集，使用K3探测器，像素尺寸0.654 ?。经过多轮二维分类、异源性重构和局部优化，最终获得高分辨率结构。

结论与意义

本研究首次揭示了铜绿假单胞菌ClpXP异源复合物的精细结构，阐明了^PaClpP2通过^PaClpP1介导的变构激活机制，以及N端无序区域和活性位点差异对底物特异性的调控作用。这些发现为针对细菌蛋白酶体的选择性抑制剂设计提供了结构基础，对治疗铜绿假单胞菌耐药感染具有重要转化价值。