新型阳离子两亲性环状拟肽的抗菌潜力：针对多重耐药菌的分子设计与稳定性研究

　　本综述重点介绍了新型阳离子两亲性环状拟肽（Cationic Amphipathic Cyclic Peptidomimetics）的开发及其对抗多重耐药菌（MDR）的应用价值。研究通过碳二亚胺介导的缩合反应，以氮杂冠醚为核心反应物，合成了不同烷基链长度的离散环状寡聚物。结果表明，疏水链长度显著影响化合物的抗菌活性（最低抑菌浓度MIC）、膜扰动效应和生物相容性，其中C16链化合物（CYPEP-C16）对多种菌株表现出最优抗菌效能（MIC=16 μg·mL?1）。尤为关键的是，该类环状化合物凭借聚恶唑啉样骨架结构，能够抵抗蛋白酶降解，维持抗菌效力，克服了传统多肽类药物的局限性。

　　

1 引言

抗菌耐药性（AMR）的蔓延已成为全球医疗卫生领域的重大挑战，据预测，若无法找到新的治疗手段，到2050年每年因AMR相关原因导致的死亡人数可能高达1000万。2019年，约有127万死亡病例直接归因于AMR感染。在过去十年中，抗菌肽（AMPs）及其合成模拟物作为一类极具前景的抗菌剂，因其多模式作用机制（包括膜破坏途径）而备受关注，能够有效杀灭细菌且不易引发耐药性。这类化合物通常由阳离子部分（如胺基）和疏水基团（如脂质分子）组成，两者的共存赋予其优异的膜作用能力。

随着可控聚合技术的发展，近年来出现了许多由阳离子和疏水基团组成的合成AMP模拟抗菌聚合物。其中，聚（2-恶唑啉）类聚合物因其在生物医学领域的应用潜力而受到广泛关注，被视为聚乙二醇的可行替代品。本研究受聚（2-恶唑啉）发展的启发，以氮杂冠醚为起始原料，通过简单的缩合反应合成了单一的、两亲性的抗菌环状拟肽，其化学结构与聚（2-恶唑啉）相匹配。这些新型环状化合物不仅表现出疏水性依赖的抗菌效应，而且由于其聚恶唑啉样骨架结构，具有增强的蛋白酶降解稳定性。

环状结构在形态上更接近天然AMPs（如达托霉素和多粘菌素），但合成具有环状结构的抗菌大分子 agent 并不容易，尤其是离散大分子。尽管如此，文献中的少量报道表明，环状聚合物通常比线性聚合物具有更好的生物性能。考虑到环状拓扑结构的优势和环状抗菌大分子 agent 的稀缺性，本研究为当前抗菌剂技术库提供了新的贡献。

2 结果与讨论

环状化合物的设计基于先前的研究，该结构组合显示出合理的抗菌活性和生物相容性。为了生成环状化合物，将三氮杂环壬烷与1-（叔丁氧羰基）-4-哌啶甲酸和不同的脂肪酸（如十二烷酸、肉豆蔻酸或棕榈酸）通过碳二亚胺化学进行反应，随后在酸性条件下去除Boc保护基。根据所用脂肪酸的长度，环状拟肽分别命名为CYPEP-C12、CYPEP-C14和CYPEP-C16。尽管这些环状化合物并非通过聚合过程获得，而是通过典型的缩合反应简单制备，但这种利用氮杂冠醚作为核心的方法具有以简便方式产生离散、单一环状大分子的优势。此外，通过柱色谱对缩合反应后的粗混合物进行纯化较为直接，整个合成的总产率平均为16 mol%，与固相肽合成技术制备合成AMPs的产率相当。

NMR分析证实了环状结构中所有关键官能团（即阳离子头、脂质尾和N-叔酰胺骨架）的存在，且产物纯度较高。GPC分析显示，经过柱纯化的Boc保护样品分子量分布非常窄（分散性? ≤ 1.03），表明其为单一物种。MS分析进一步验证了最终去保护环状化合物的形成，双电荷和单电荷H⁺加合物（峰I、III、V和II、IV、VI）在质谱图中清晰可检测，且实验分子离子值与理论值匹配良好。鉴于环状化合物具有两亲性，通过DLS分析确定了这些大分子在水中的自组装能力。在样品浓度为128 μg·mL^?1时，DLS测量显示了单峰强度分布，具有良好至中等的多分散指数（0.29至0.31），CYPEP-C12、CYPEP-C14和CYPEP-C16的平均流体动力学直径（D_H-avg）值分别为179、218和355 nm。这一观察结果确实证实了环状化合物在水中自组装形成纳米颗粒的能力。此外，在水中进行的Zeta电位测量显示，环状化合物确实呈阳离子性，CYPEP-C12、CYPEP-C14和CYPEP-C16的Zeta电位值分别为14 ± 2、24 ± 3和31 ± 1 mV。基于表征结果，可以得出结论：环状拟肽已成功制备。

随后通过测定其对不同细菌的最低抑菌浓度（MIC）值评估了环状化合物的抗菌活性（抑菌效能）。测试的细菌包括野生型铜绿假单胞菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌，以及源自眼部感染的模式MDR铜绿假单胞菌菌株（PA31和PA37）。结果表明，化合物的抑菌活性随着烷基链长度（疏水性）的增加而增强。CYPEP-C12仅对铜绿假单胞菌（包括野生型和MDR菌株）具有中等活性，MIC值为128 μg·mL^?1，但在该浓度下对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌无活性。而CYPEP-C14对革兰氏阴性菌的MIC值一般为64 μg·mL^?1，且对革兰氏阳性金黄色葡萄球菌更为有效（MIC = 16 μg·mL^?1），CYPEP-C16则能优异抑制所有测试菌株的生长，平均MIC值接近16 μg·mL^?1。环状化合物抗菌效力随烷基链长度增加而增强的现象并不意外，这可能与更疏水的基团能够引起更强的膜破坏事件相关，从而导致更好的抗菌活性。

为了确认这一点，研究了化合物对野生型铜绿假单胞菌外膜和内膜的膜破坏能力。对于外膜实验，细菌细胞首先在1×MIC的环状化合物中敏化10分钟，随后再用阴离子表面活性剂脱氧胆酸钠处理10分钟。如果细菌外膜受到环状化合物的影响，细胞在第二次与脱氧胆酸钠孵育时会裂解，外膜破坏程度可以通过相对于阴性对照（即用磷酸盐缓冲盐水（PBS）“敏化”的细胞）的光密度变化来测量。所有三种环状化合物在扰动外膜方面同样出色，导致光密度减少70%–75%，与AMP蜂毒肽相当。虽然外膜测定未显示尽管化学结构不同但活性存在明显差异，但内膜测定的结果却显示出不同。内膜测定使用碘化丙啶（PI）染料进行，其中膜通透性程度与PI的红色荧光强度相关，PI在穿过弱化膜壁并与细胞内核酸嵌入后发出红色荧光。等高线图清晰显示，随着烷基链长度从CYPEP-C12增加到CYPEP-C16，红色荧光强度增加，从而证实具有更高疏水性的化合物具有更强的细胞膜破坏能力。基于这两个膜实验，还可以推断革兰氏阴性菌的内膜比外膜更难破坏。

接下来，通过测定化合物引起绵羊红细胞（RBCs）溶血倾向和对鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）的毒性来评估其生物相容性。具体而言，测定了HC₅₀（溶血50%红细胞的浓度点）和IC₅₀（半数抑制浓度）值。不出所料，具有最低抗菌效力和最低膜破坏能力的CYPEP-C12在三种环状化合物中具有最高的HC₅₀和IC₅₀值，而尽管CYPEP-C16对细菌高效，但对RBCs和MEF细胞的毒性最大，其毒性特征与AMP蜂毒肽相当，后者也具有较低的治疗指数（TI，定义为HC₅₀/MIC或IC₅₀/MIC的比率）。尽管CYPEP-C16生物相容性较差，但这很可能通过笼蔽负责毒性的官能团（阳离子或疏水基团）来规避，使整个大分子呈惰性，随后响应特定触发因素解笼蔽，以赋予局部和靶向活性。这种笼蔽/解笼蔽AMP模拟物的方法已通过不同的触发化学成功证明。另一种方法是将CYPEP-C16与常规抗生素联合应用，因为在协同组合中实现相同抗菌效果所需的环状化合物剂量远低于其作为单独药剂时的剂量。

开发这些环状拟肽的一个关键动机是克服AMPs和其他聚酰胺模拟物可能易受蛋白酶降解的缺点。多肽通常由于易受胃肠道中蛋白酶酶促降解而显示出口服生物利用度低，这可能阻碍其临床应用。然而，文献表明，通过使用修饰的多肽骨架结构，其中酰胺基团中的氮原子被碳侧链取代形成类肽，可以获得增强的抗蛋白酶降解稳定性。有趣的是，聚恶唑啉在结构上类似于类肽，尽管前者具有N-取代酰胺作为侧链，而后者将相同的官能团嵌入聚合物主链中。尽管存在区别，这两类聚合物共享相同的关键官能团，与多肽和其他聚酰胺相比，能够实现更高的抗蛋白酶降解稳定性。为了验证此处类似于聚恶唑啉的环状拟肽确实比其他物质更稳定于蛋白酶降解，将环状化合物与另外两种具有不同骨架结构的抗菌大分子——具有常规肽键的Dendron和通过丙烯酰胺单体的可逆加成-断裂链转移（RAFT）聚合制成的Polymer——一起用两种不同的模型蛋白酶（即来自番木瓜的木瓜蛋白酶和来自牛脾的组织蛋白酶B）进行蛋白酶降解处理，随后通过对野生型铜绿假单胞菌的MIC测定来确定化合物在遇到蛋白酶后其抑菌能力是否受到影响。结果表明，所有环状化合物的MIC即使在经过任一种蛋白酶处理24小时后仍保持不变，从而表明化学键稳定，没有发生结构完整性损失导致化合物抗菌活性降低。另一方面，Dendron化合物的MIC增加了两倍，表明肽键由于蛋白酶解而遭受了一些温和的切割，但程度不严重。Polymer的情况则不同，RAFT衍生的大分子在蛋白酶处理后显示出MIC值大幅增加，其中经过木瓜蛋白酶和组织蛋白酶处理后，MIC分别从32跳升至256 μg·mL^?1（八倍）和128 μg·mL^?1（四倍）。与Dendron相比，Polymer对蛋白酶降解的更高敏感性有趣且出乎意料，考虑到Polymer侧链的酰胺是N-取代的，而Dendron中的则不是。一个初步的假设是，这可能归因于Polymer主链在羰基碳相邻处具有仲碳，这可能导致更高的蛋白酶解速率，不像在Dendron中，相邻羰基碳是伯碳。然而，这一论点与环状化合物表观稳定性有些矛盾，因为阳离子侧链在羰基碳相邻处有一个仲碳，尽管连接疏水烷基尾的仍然是伯碳。需要完整的结构-降解研究来进一步阐明这些结果。无论如何，具有类似于聚恶唑啉的N-取代叔酰胺骨架的环状化合物表现出比其他大分子更强的蛋白酶稳定性，尽管我们谨慎指出，体外实验中使用的酶浓度可能高于实际体内条件，因此结果严格并不意味着其他抗菌大分子不适合实际应用。

3 结论

总之，我们开发了新型的、离散的阳离子两亲性环状拟肽，具有抗菌特性。环状化合物的合成通过涉及氮杂冠醚作为核心反应物的常规缩合反应以简便方式进行。化合物的疏水性（烷基链长度）在调节其抗菌活性、膜破坏能力和毒性方面起着重要作用，更高的疏水性导致性能增强，反之亦然。重要的是，聚恶唑啉样骨架结构使环状化合物能够抵抗蛋白酶降解并保持其抗菌效力，这与其他聚酰胺系统不同。本研究强调了这些环状拟肽作为新型治疗剂对抗抗菌耐药性的潜力，同时为功能化聚恶唑啉的快速扩展研究做出了贡献。