欧洲多中心研究评估OSNA一步核酸扩增技术在子宫内膜癌前哨淋巴结检测中的诊断准确性

　　本研究前瞻性评估了一步核酸扩增技术（OSNA）对比超分期病理检测（ultrastaging）在子宫内膜癌（EC）前哨淋巴结（SLN）转移诊断中的性能。结果显示OSNA具有高一致性（95%）和特异性（97.6%），但灵敏度较低（41.2%），主要归因于组织分配偏差。该技术为术中快速、标准化的淋巴结评估提供了新方向。

　　

ABSTRACT

本研究旨在通过比较一步核酸扩增（OSNA）与超分期病理检测方法，评估OSNA在子宫内膜癌患者前哨淋巴结转移检测中的诊断准确性。结果显示，在淋巴结水平和患者水平上，OSNA与超分期检测的一致性分别为95%和93.2%，特异性分别为97.6%和96.2%，但灵敏度较低，分别为41.2%和47.8%。反向分析中，超分期检测相对于OSNA的灵敏度也较低。两种方法在95%的淋巴结中结果一致，但存在6.33%的差异节点，其中85.1%为微转移。研究结论认为OSNA具有高一致性和特异性，但灵敏度受限，主要由于组织分配偏差。

1 Introduction

子宫内膜癌（EC）在欧洲每年新增病例超过12.4万例，死亡约3万例，发病率持续上升。近年来，前哨淋巴结（SLN）概念已成为早期子宫内膜癌管理的重要组成部分，其检测和通过超分期进行的详细病理学检查已成为手术分期的关键组成部分。然而，超分期检查需要专家病理学家，且SLN超分期方案未标准化，各中心之间存在差异。因此，需要一种广泛适用、准确、可重复且可标准化的方法用于EC手术分期。一步核酸扩增（OSNA）分子方法被认为是一种合适的替代方案。OSNA相较于超分期的主要优势在于其高度自动化和标准化，从而最小化观察者变异性并减少对解释性病理学技能的依赖。另一个采用OSNA的原因是其能够实时、术中评估SLN。OSNA基于细胞角蛋白19 mRNA（CK19 mRNA）在淋巴组织中的检测，通过逆转录环介导等温扩增（RT-LAMP）检测样本中CK19 mRNA的精确拷贝数。结果可在约30分钟内获得，支持术中应用。OSNA测定已在乳腺癌SLN转移的术中检测中得到广泛验证，并在日本、德国和英国等多个国家融入临床实践。关键研究采用与我们调查相似的方法，证明了OSNA的诊断准确性。最近，不同研究检验了OSNA在EC患者淋巴结宏转移和微转移检测中的应用，并将该方法与标准病理学和超分期进行比较。然而，这些研究要么在上一代OSNA分析仪（RD 100i）上进行，要么队列规模有限。因此，需要更可靠的数据来评估OSNA在EC临床实践中的应用。这项前瞻性欧洲多中心研究（EU-OSNA）的主要目的是评估OSNA在EC患者SLN转移检测中的诊断准确性，以病理超分期作为参考标准。

2 Methods

2.1 Study Protocol

这是一项前瞻性多中心诊断准确性研究，涉及5个欧洲国家的10个肿瘤中心。研究根据《赫尔辛基宣言》的伦理原则、良好临床实践以及参与中心的任何地区或国家法规进行。潜在合格患者收到研究信息，仅在提供有效书面知情同意后纳入。研究纳入标准包括年龄≥18岁、诊断为EC（无论组织学亚型）、计划进行包括前哨淋巴结绘图（SLNM）的手术治疗并提供签署知情同意的女性患者。如果未获得知情同意或SLNM不成功，则不纳入患者。术前成像和SLNM指征根据各参与肿瘤中心的常规临床实践进行，不受研究设计限制。招募目标为至少300名患者。符合研究纳入标准的患者在2020年8月至2022年11月期间在以下参与中心接受手术：比尔森大学医院（捷克共和国；主要研究者所在地）、卡托维兹大学医院（波兰）、Czeladz医院（波兰）、弗罗茨瓦夫下西里西亚肿瘤学、肺病学和血液学中心（波兰）、拉巴斯大学医院（马德里，西班牙）、弗留利中央大学卫生局（乌迪内，意大利）、阿诺·德维兰诺瓦大学医院（莱里达，西班牙）、国家肿瘤学研究所（布达佩斯，匈牙利）、阿拉巴大学医院（维多利亚-加斯泰兹，西班牙）以及拉费大学医院和理工大学（瓦伦西亚，西班牙）。所有研究数据收集在中央REDCap电子数据库中。患者根据参与中心的本地协议进行术前检查和后续手术治疗。接受任何手术方法，包括腹腔镜、机器人辅助或开腹手术。所有SLN同时通过OSNA（索引测试）和病理超分期（金标准测试）进行检查。进一步的临床管理基于超分期结果，符合当前国际建议。

2.2 Sentinel Lymph Node Mapping and Processing

通过浅层（1–3 mm）和深层（10–20 mm）宫颈注射示踪剂进行SLNM，根据NCCN示踪剂应用算法进行。推荐使用吲哚菁绿（ICG）作为SLNM方法，因为其与其他技术相比具有高可靠性和每半骨盆SLN识别率。但也接受参与中心选择的染料。 harvested SLN的数量和解剖位置记录在电子REDCap数据库中。在无菌条件下，清除淋巴结周围脂肪组织，避免与任何上皮接触，并垂直于淋巴结长轴以2 mm厚度连续切片。奇数和偶数切片分别送OSNA分析和病理超分期。长轴4 mm及以下的SLN切成两半，一半分配给OSNA，另一半分配给超分期。

2.3 Ultrastaging

用于超分期的切片在10%缓冲福尔马林中固定，包埋在石蜡块中，提交给病理学家。从每个石蜡块中，以150 μm间隔切片。每个水平切三个相邻切片，每个水平的第一个切片用苏木精和伊红（H&E）染色。第二个切片用免疫组织化学（IHC）染色，使用抗细胞角蛋白AE1:AE3检测低体积转移性疾病。第三个保留作为备用切片，需要时用于重复染色。如果未检测到微转移或宏转移，则认为SLN阴性。如果转移被认为>0.2 mm，则认为SLN阳性（>2.0 mm = 宏转移；>0.2 mm但≤2.0 mm = 微转移）。孤立肿瘤细胞（ITCs；肿瘤细胞簇≤0.2 mm）的发现被记录，但节点被视为阴性。

2.4 OSNA Analysis

OSNA分析根据制造商说明进行。专用于OSNA分析的SLN切片置于无菌活检样本容器中，立即冷藏（2°C–8°C）或冰上储存（0°C–4°C）以避免RNA降解，并紧密固定以避免组织脱水。所有研究中心建议手术与实验室之间的运输时间在15分钟内。如果OSNA不能在节点切除后8小时内进行，样本在?80°C储存。用于均质化的OSNA样本重量可接受范围为25–600 mg。对于超过600 mg的样本，必须将组织细分为子样本。由于OSNA方法可以处理整个淋巴结，同一节点的切片汇集到一个瓶中进行储存和进一步分析。冷冻样本在4 mL裂解缓冲液中均质化，按照制造商说明（Sysmex，日本神户）。使用LYNOPREP Blade Set进行离心。然后裂解液在OSNA分析仪RD-210中处理，通过RT-LAMP进行CK19 mRNA的等温扩增。SLN根据从乳腺癌转移描述采用的既定截断值定义为“阴性”或“阳性”。CK19 mRNA少于250拷贝/μL的SLN分类为阴性，mRNA CK19水平在250至4999拷贝/μL之间分类为微转移阳性（+），CK19 mRNA水平为5000 mRNA拷贝/μL或以上分类为宏转移阳性（++）。

2.5 Primary Tumor Examination

在每个原发性子宫肿瘤中进行CK19的免疫组织化学检测以确认其表达（任何阳性都被考虑）。

2.6 Statistical Analysis

通过定量总结使用均值、中位数、绝对计数和百分比描述研究人群。我们分析的主要目标是描述OSNA方法与超分期相比的灵敏度、特异性、阳性和阴性预测值以及一致性。还进行了反向数据分析，以OSNA为标准，超分期为索引测试。主要终点是淋巴结水平的诊断准确性。还通过聚类分析评估患者水平的诊断性能，分析属于同一患者的SLN数据。

2.7 Quality Assurance

为保证质量，要求提交所有标本和完整病理报告，至少来自每个中心两名患者（由主要研究者随机选择），并在捷克共和国查理大学比尔森大学医院Sikl病理科进行中央审查。如果发现与研究协议的重大偏差，则审查其他案例。根据期刊指南，我们将提供数据供编辑团队选择的团队进行独立分析，用于额外数据分析或应要求在其他中心重现本研究。

3 Results

2020年8月至2022年11月期间，共有366名患者被招募入研究，共检查743个SLN。SLNM在313名（85.52%）患者中双侧成功，在53名（14.48%）患者中单侧成功。其中364名（99.45%）患者应用了ICG作为示踪剂。各一名患者使用了蓝色染料和磁性示踪剂。32名（8.75%）患者进行了系统性盆腔±主动脉旁淋巴结切除术和SLN检测。患者特征如表1所示。SLN的最长平均轴长度、平均重量和厚度分别为14.19 mm（7.19）、240.82 mg（281.26）和2.15 mm（0.47）。进一步的SLN特征及其病理学和OSNA检查结果如表2所示。所有366个原发性肿瘤都通过免疫组织化学测试了CK19蛋白的表达。其表达在100%的测试肿瘤中得到确认，无论其组织学如何，平均CK19表达为77.30%（SD 23.85%），中位数为80%（四分位距[IQR] 30）。平均肿瘤大小为29.7 mm（SD 1.74），中位数为27.0 mm（1–100 mm）。我们专注于比较两种方法在淋巴结水平和患者水平的结果。OSNA与病理学检查的一致性率在淋巴结水平和患者水平分别为95%和93.2%（表3）。超分期检测到总共22个（2.96%）微转移和12个（1.62%）宏转移。在阴性结果中，有7个（0.94%）病例有孤立肿瘤细胞（ITCs）。OSNA检测到总共24个（3.23%）微转移和7个（0.94%）宏转移。在4个（0.56%）阴性结果病例中，CK19 mRNA拷贝水平刚好低于阴性阈值，即在160至249拷贝/μL之间。然而，两种方法仅在1个检测到的宏转移病例和3个微转移病例中一致。无论转移大小，两种方法在14个阳性节点和692个阴性节点中一致—95%（表4）。

4 Discussion

4.1 Summary of Main Results

在这项最大的欧洲多中心前瞻性研究中，我们分析了OSNA与病理超分期在接受手术治疗的EC患者SLN中的诊断准确性。在我们的患者队列中，OSNA与病理超分期在淋巴结水平相比具有95%的一致性、97.6%的特异性和41.2%的灵敏度，在患者水平相比具有93.2%的一致性、96.2%的特异性和47.8%的灵敏度。相反，当OSNA被设定为标准方法时，超分期在淋巴结水平和患者水平的反向灵敏度分别为45.2%和45.8%。OSNA检测到的转移节点总数为31个，超分期为34个，而患者水平的差异分别为24名和23名节点阳性患者。

4.2 Results in the Context of Published Literature

在一致性、特异性和灵敏度方面，我们的结果与La Fera等人关于类似大小节点样本（668个SLN）的研究一致。他们的工作描述了高一致性（96.7%）和特异性率（98.4%）。由于他们还使用OSNA和超分期分析了不同的节点部分，他们观察到大量不一致节点（3.3%），导致灵敏度为50%。在我们的案例中，两种方法的灵敏度甚至更低，与更大比例的不一致案例有关，743个中有47个（6.33%）。在Diestro等人2021年发表的多中心研究中，分析了191名患者的526个前哨淋巴结，使用不同的组织分配协议。具体来说，每个节点的1 mm中央切片通过超分期检查，而剩余组织进行OSNA。这种方法导致OSNA检测到更高的转移率，导致13.6%的不一致案例和8.2%的患者分期上升。OSNA检测增加可能部分归因于组织分配偏差，因为每个淋巴结的大部分通过OSNA分析而不是超分期。在其他先前发表的论文中，OSNA的灵敏度据报道显著更高，高达100%。高灵敏度值主要在单中心研究中实现， conducted on a significantly smaller population sample. 在这种情况下，组织分配偏差的问题似乎不那么明显，可能也由于SLN切片厚度的样本内变异减少。在我们的OSNA结果中，有15例微转移和2例宏转移，超分期结果为阴性。另一方面，有OSNA阴性的SLN，超分期结果为微转移和宏转移阳性，分别为15例和5例。在OSNA阴性不一致SLN中发现的转移中位大小为0.8 mm（0.2–6），而在超分期阴性SLN中，OSNA检测到的中位值为810 CK-19 mRNA拷贝/μL（300–28,000），对应于微转移。这进一步证实，在节点肿瘤负荷小的情况下，用两种不同方法分析同一组织的不同切片可能导致样本分布不公平和不一致率升高。据报道，这种差异会导致患者FIGO分期改变。确实，据报道，11名（3%）FIGO I期和2名（0.55%）FIGO II期患者根据OSNA会分期上升至FIGO III。相比之下，根据超分期为FIGO III的12名（3.3%）患者通过OSNA会分期下降至FIGO I（9名患者）、FIGO II（2名患者），并且1名患者会被分类为FIGO IIIB而不是FIGO IIIC1。

4.3 Strengths and Weaknesses

据我们所知，这是迄今为止分析OSNA在EC患者中临床性能的最大研究。研究在10个欧洲中心进行，历时3年，招募了总共366名患者，检查了743个SLN。我们研究的最大弱点是阳性节点比例相对较低以及由于无法使用两种方法测试相同组织样本而导致的组织分配偏差风险。然而，数据的反向分析以OSNA为标准方法显示结果分布相似，淋巴结水平的反向灵敏度和反向特异性分别为45.2%和97.2%，患者水平分别为45.8%和96.5%。根据我们的研究，两种方法，超分期和OSNA，在研究人群中产生了可比的转移淋巴结 involvement比例。我们研究中使用的当前一代OSNA分析仪（RD-210）是CE认证的，完全符合指令98/79/EC。它被验证用于妇科恶性肿瘤，扩大了前一代模型（RD-100）的范围，后者主要应用于乳腺、结直肠和胃癌。与前代相比，RD-210提供了 several technical advancements：它可以同时处理多达14个样本，具有更短的扩增时间，并包括自动化功能—例如试剂和样本管理以及数据跟踪—这些以前是手动执行的。由于淋巴结的不同部分用于索引和参考测试，迄今为止发表的研究中描述的性能指标，包括本研究，不能被认为是完全精确的。正确使用术语“灵敏度”和“特异性”需要