厄瓜多尔白色念珠菌临床分离株中ERG11、MDR1和CDR1基因的基础表达：揭示唑类药物耐药性监测新视角

　　本综述系统探讨了厄瓜多尔临床分离的白色念珠菌中唑类耐药基因（ERG11、MDR1、CDR1）的基础表达模式，通过RT-qPCR技术揭示其表达水平与耐药性机制的内在关联，为发展中国家真菌耐药性流行病学监测（Surveillance）提供关键分子依据，对临床抗真菌药物（Azoles）策略优化具有重要指导意义。

　　

摘要

白色念珠菌（Candida albicans）作为机会性病原体，与严重且常致命的感染相关。唑类药物（Azoles）是治疗的一线药物，但其耐药性在全球范围内日益增多。唑类耐药机制涉及ERG11、MDR1和CDR1等基因的过表达和突变。本研究旨在通过了解厄瓜多尔境内唑类耐药相关基因的基础表达，监测药物耐药性的流行情况。

引言

真菌感染每年导致全球超过150万人死亡，死亡率高达50%。尽管其影响重大，真菌感染在医院护理中常被忽视。免疫缺陷人群（如癌症患者、移植接受者、HIV感染者和老年人）的增加导致严重真菌相关疾病的上升。其中，念珠菌属（Candida species）的侵袭性感染是住院患者中最普遍的。

念珠菌属通常是人类正常微生物群的一部分，但在免疫缺陷患者中可成为机会性病原体，引起严重感染。遗憾的是，过去二十年中念珠菌血症的发病率翻倍，占全球医院内血流感染的9%。念珠菌是从血培养中最常分离出的五种病原体之一。感染风险的增加源于微生物组成改变或宿主免疫系统破坏，促进真菌入侵。在念珠菌属中，白色念珠菌是人类中最普遍的机会性真菌。其致病性得到多种毒力因子的支持，包括芽管形成、黏附素、生物膜、水解酶、酵母和菌丝形态之间的转换。此外，白色念珠菌可快速对常用抗真菌药物（如唑类、多烯类、棘白菌素类和抗代谢药物）产生耐药性。

目前批准用于治疗真菌病的主要抗真菌药物类别包括唑类（氟康唑Fluconazole、伏立康唑Voriconazole、伊曲康唑Itraconazole和泊沙康唑Posaconazole）、多烯类（两性霉素B Amphotericin B）、棘白菌素类（卡泊芬净Caspofungin、阿尼芬净Anidulafungin、米卡芬净Micafungin）和抗代谢药物（5-氟胞嘧啶5-Fluorocytosine）。唑类药物抑制ERG11编码的羊毛甾醇14-α-脱甲基酶（lanosterol 14-alpha-demethylase），阻断麦角固醇合成（对真菌膜完整性至关重要），导致有毒固醇积累和活性氧物种（ROS）增加，最终损害真菌生长。值得注意的是，自2000年代中期以来未有新的抗真菌药物类别推出。

然而，念珠菌属可通过多种机制发展唑类耐药性，包括染色体变化（如ERG11、TAC1和MRR1区域的杂合性缺失）、等臂染色体[i(5L)]形成、细胞应激反应通路激活（如Hsp90、Sgt1、钙调神经磷酸酶Calcineurin、KDACs、PKC）、ERG3突变或抑制、多药转运蛋白（CDR1、CDR2和MDR1）的上调，以及ERG11的过表达和结构改变（降低唑类结合亲和力）。

唑类耐药性可能源于属于ATP结合盒（ABC）和主要易化子超家族（MFS）转运蛋白的外排泵，分别由CDR和MDR基因编码。这些转运蛋白通过主动将唑类化合物跨细胞膜输出，降低细胞内药物浓度。研究已将外排泵基因（尤其是CDR1，ABC转运蛋白中的主要贡献者）表达增加与氟康唑耐药性增加相关联，特别是在早期生物膜形成过程中。因此，必须识别这些耐药基因的存在和表达水平。

白色念珠菌中氟康唑耐药性的增加主要归因于其广泛和长期使用。这限制了住院患者侵袭性感染的有效治疗选择，并代表日益增长的公共卫生问题。应对这一日益增长的挑战需要迫切和创新的策略来对抗机会性真菌病原体的抗真菌耐药性。

在厄瓜多尔，2018年的抗菌素耐药性报告仅关注细菌病原体，忽略了念珠菌属和其他真菌。关于真菌流行病学的数据仍然有限，缺乏对白色念珠菌的基因组研究阻碍了对其现状的清晰理解。分子表征对于追踪病原体进化和指导治疗策略至关重要。本研究旨在通过实时PCR（RT-qPCR）测定先前从厄瓜多尔医疗中心分离的临床样本中MDR1、CDR1和ERG11基因的基础表达水平，为白色念珠菌的流行病学监测做出贡献。

方法

白色念珠菌分离株和培养条件

从2019年1月至2020年2月，从厄瓜多尔瓜亚基尔的一家三级医院收集了总共53株白色念珠菌临床分离株，作为常规诊断分析的一部分。样本收集的细节先前已有描述。简而言之，将酵母样菌落分离到沙氏葡萄糖琼脂（SDA-Oxoid, ThermoScientific, Waltham, MA, USA）上，补充氯霉素（0.05 g/L），并在37°C培养24/48小时，然后进行革兰染色和形态观察。初步使用HardyCHROM? Candida (CRITERION?, Hardy Diagnostics, Santa Maria, CA, USA)进行鉴定，样本在37°C培养48小时，并使用VITEK 2系统（bioMérieux, Inc., Hazelwood, MO, USA）和YS卡按照制造商指南进行。分离株保存在沙氏葡萄糖琼脂（SDA Merch, Germany）培养基和CHROM琼脂培养基（CAC, Becton Dickinson, Heidelberg, Germany）中，在37°C培养48小时，然后评估菌落形成单位（CFU）。为了长期储存，分离株在40%甘油无菌水中于-80°C保存。使用VITEK 2系统（bioMérieux, Inc.）和YS08卡对36株分离株进行了氟康唑敏感性测试，遵循制造商的说明。分离株由圣灵大学真菌学实验室匿名提供，列于补充表1。同时，使用ATCC MYA-3573作为参考。

白色念珠菌分离株的分子表征

为了进行分子表征，使用PureLink? Genomic DNA Mini Kit (Invitrogen, Waltham, MA, USA)从新鲜培养物中提取基因组DNA，遵循制造商的协议，并在裂解步骤前进行修改：酵母培养物在4000 r.p.m下离心10分钟，并悬浮在原生质体缓冲液（1M山梨醇溶液，12 mg/mL溶菌酶（Invitrogen?）和1.5 mM β-巯基乙醇（Sigma-Aldrich?））中。将悬浮液均质化，然后与180 μL消化缓冲液和真菌特异性蛋白酶K（20 mg/mL, Invitrogen?）在65°C孵育30分钟。随后加入RNA酶A并在室温下孵育10分钟。在10,000× g离心5分钟后，收集上清液并与200 μL 100%乙醇混合，短暂涡旋。将溶液加载到旋转柱上，并在10,000× g离心1分钟。随后的纯化步骤遵循标准制造商的协议。

使用引物ITS-1 (5′-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3′)和ITS-4通用引物(5′-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3′)在标准循环条件下通过PCR扩增rDNA的内转录间隔区（ITS）。通过1.5%琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物。纯化的扩增子由Macrogen（首尔，韩国）进行测序，并使用Geneious Prime 2023（版本2023.0.4）软件进行一致性序列分析，通过BLAST比对算法验证分类学归属。ITS序列可在Bioproject PRJNA1077920（Genbank ID: PP503965-PP504130）中获取。

MDR1、CDR1、ERG11基因表达优化的引物设计

从NCBI获取候选基因MDR1、CDR1和ERG11的编码序列，列于表1。选择的引物参数包括扩增子长度在70-200 bp之间，熔解温度在55°C至63°C之间，3′端残基包含C-G，避免引物自身形成，GC含量约为50-60%。通过BLAST评估引物的特异性，并由Macrogen?（韩国）公司合成。肌动蛋白基因（ACT1）的引物在所有qPCR反应中用作内参。通过实时PCR评估最佳退火温度，并通过熔解曲线分析验证引物产生特异性PCR产物。在熔解曲线期间，qPCR中多个峰的存在导致相应引物对被移除。简而言之，qPCR条件包括初始温度50°C 3分钟，95°C变性5分钟（一个循环），95°C 15秒，以及66°C退火和延伸30秒（40个循环）。每个反应包括一个熔解曲线步骤（从58°C开始，以0.5°C/秒逐渐增加到95°C，每0.05秒采集数据）。通过运行四个临床DNA样本的重复来评估qPCR中的测定内变异。结果反映了高水平的精确度（CV < 10%）。

HWP1克隆和标准曲线

含有HWP1基因600 bp片段的质粒先前已被克隆并用于标准曲线生成，进行定量并转换为拷贝数浓度。制备十倍系列稀释于超纯水中，以产生从1×10⁹到1×10⁰拷贝/μL的动态范围。使用CFX96实时PCR系统（Bio-Rad）进行定量PCR，通过CFX Manager软件分析扩增数据，基于Ct值和线性回归生成标准曲线。该标准曲线用于计算测试样本中的绝对转录水平，遵循先前验证的程序。

白色念珠菌分离株的RNA提取和cDNA合成

酵母细胞在酵母提取物-蛋白胨-葡萄糖（YPD）肉汤培养基中于37°C过夜生长。孵育后，将细胞调整至1×10⁷细胞/mL在5 mL液体YPD肉汤中，于37°C收集并通过离心。细胞在液氮中速冻并保存在-80°C以保持RNA完整性。使用Total RNA Kit I (Omega Bio-Tek, Inc., Norcross, GA, USA)提取总RNA，按照制造商的说明。使用分光光度法（Synergy HTX BioTek）评估RNA浓度和纯度。所有RNA样品稀释至最终浓度40 ng/μL。

在RNA分离后立即使用Superscript双链cDNA合成试剂盒（Invitrogen）进行cDNA合成，遵循制造商的建议。简而言之，将1 μL oligo (dT)20、1 μL稀释的RNA、1 μL dNTPs和10 μL超纯水的混合物加热至65°C 5分钟，然后在冰上冷却。随后加入First-Strand缓冲液、DTT、RNaseOUT和逆转录酶（SuperScript III RT）。逆转录反应在50°C进行60分钟，然后在70°C灭活15分钟。假定所有样本的反应效率相同。

通过RT-qPCR进行基因表达分析

使用RT-qPCR在CFX96实时系统（Bio-Rad）上对CDR1、MDR1、ERG11基因进行绝对定量。每个反应在总体积7.5 μL中重复运行，包括3.75 μL FastGene qPCR Master Mix (Nippon Genetics)、0.3 μM每个基因特异性引物（表1）和3 μL稀释的cDNA。扩增方案包括初始变性95°C 3分钟，随后40个循环的95°C 15秒和60°C 30秒。生成绝对定量的标准曲线。ACT1引物用作内参以验证逆转录可行性，并使用先前描述的标准曲线。白色念珠菌菌株（DCA49）的DNA样本在通过VITEK Cassette确认其唑类耐药性后用作阳性对照。使用BioRad Maestro CFX（软件）以Sq（测序拷贝数）单位显示通过qPCR测量的基因表达水平。

统计分析

分析qPCR数据以识别白色念珠菌分离株中ERG11、MDR1和CDR1的基础基因表达水平。使用R Studio中的Fisher精确检验配对进行统计分析，显著性阈值设定为p < 0.05。使用GraphPad Prism（美国）生成临床分离株与ATCC参考菌株之间的比较图。

结果

总共从各种来源收集了53株白色念珠菌临床分离株（表3）。最常见的临床分离株来自尿液（n = 16, 30.19%），其次是呼吸道分泌物（n = 14, 26.41%）、阴道分泌物（n = 8, 15.09%）、血培养（n = 7, 13.21%）、导管（n = 4, 7.55%）、伤口（n = 3, 5.66%）和胸腔积液（n = 1, 1.89%）。氟康唑的体外抗真菌敏感性测试产生了36株分离株的数据，其中95%敏感，5%耐药。然而，剩余的17株分离株未确定（补充表1）。

对于表达分析中的引物选择，确定了最佳退火温度，并通过熔解曲线分析验证引物产生特异性PCR产物。使用引物组Fw4/Rv4、Fw3/Rv3和Fw5/Rv5分别量化MDR1、CDR1和ERG11的表达水平。为确保准确性和可重复性，使用重复样本评估了每个引物的变异系数（CV）：MDR1的CV为9.59，CDR1的CV为3.47，ERG11的CV为4.12。这表明qPCR检测中表达水平的变异性较低。通过使用DNA模板的系列稀释评估扩增效率（E），效率范围从83%到107%。引物效率为：MDR1为107.1%，CDR1为83.4%，ERG11为95.5%（补充图1）。

MDR1、CDR1和ERG11的基因表达频率如图1所示。ERG11基因显示最高表达频率，其次是CDR1和MDR1。大多数样本（n = 39, 73.58%）在所有三种耐药基因中的表达水平高于ATCC，而只有一株分离株，#19 (DCA#42)，在任何三种基因中的表达均未超过ATCC。值得注意的是，在本研究中，除了另一种耐药基因的表达外，还观察到MDR1基因表达。

临床分离株中MDR1、CDR1和ERG11的基础基因表达有助于识别白色念珠菌在缺乏刺激（如氟康唑）的情况下的行为。RT-qPCR结果的统计分析显示，三种基因的平均拷贝数存在显著差异（表2）。与ERG11（5.20E + 04）和MDR1（1.69E + 04）相比，CDR1表达显示最高平均拷贝数（7.12E + 04）。值得注意的是，这些结果强调，在分离株#32 (DCA70)中观察到的高基因表达（4.49E + 05）影响了CDR1绝对定量的平均值（图2B）。同样，在分离株#30 (DCA45)中，关于MDR1表达（6.47E + 05）是三种基因中最高的。尽管ERG11具有较高的表达频率（表2），但其表达水平在分离株之间高度可变。分离株#2 (KCA4)和#31 (DCA60)表现出较高的基因表达水平。这显示了与唑类耐药相关基因的基础表达高度方差（图2）。

与ATCC表达相比，白色念珠菌临床分离株中MDR1、CDR1和ERG11的基础表达差异如图2所示。ATCC的绝对定量（拷贝/1000000）分别为MDR1 = 3.67E + 01，CDR1 = 1.99E + 02，ERG11 = 5.78E + 02。大多数分离株（n = 41, 77.36%）超过ATCC的表达水平（3.67E + 01）。然而，表达水平是可变的。12株分离株的表达水平未表达该基因，或其表达水平低于ATCC。

我们比较了ATCC参考菌株和临床分离株之间MDR1、CDR1和ERG11的平均基础表达水平（sq）的差异（图3）。在所有临床分离株中检测到的平均基因转录本数量高于参考ATCC中检测到的数量。此外，在本研究分析的临床分离株中，平均基础表达水平存在差异。

我们评估了超过ATCC参考菌株表达水平的基因表达是否与分离株的临床来源相关（表3）。对于MDR1，33.33%的过表达分离株源自尿液，其次是21.43%来自呼吸道分泌物（RTS）。类似地，CDR1过表达在尿液和RTS中最常见（均为26.67%）。在ERG11的情况下，30.61%的过表达分离株来自尿液，其次是24.49%来自RTS。尽管存在这些趋势，但所有关联均未达到统计显著性（p > 0.05）。因此，未观察到基因过表达与样本来源之间的显著相关性。此外，表达水平在分离株之间变化很大，每个基因都有随机峰值（图4）。

在53株临床分离株中，来自血液样本的分离株在MDR1（平均 = 1.14E + 04）、CDR1（平均 = 6.47E + 04）和ERG11（平均 = 6.35E + 04）中显示出高表达水平。分离株#2 (KCA4)显示最高的ERG11表达（2.30e + 05）。来自导管、尿液、阴道分泌物和伤口的表达谱显示相似的分布谱。然而，异常值影响了表达均值，例如来自呼吸道分泌物的分离株#30 (DCA45)显示最高的MDR1表达（6.47E + 05），将该组的均值提高至4.94E + 04。尽管如此，大多数呼吸道分离株具有一致的表达水平。所有阴道分泌物分离株的平均表达对于CDR1（1.17E + 05）最高，与其他来源相比。在ERG11上，在来自伤口样本的分离株#31 (DCA60)中发现最高表达水平（3.02E + 05）。伤口分离株的平均表达为1.23E + 05，是临床分离株中ERG11最高的。尿液样本中CDR1和ERG11的绝对定量分布具有相似性。无法确定胸腔积液中的表达变异性，因为我们只有1株来自该来源的分离株。

讨论

白色念珠菌已被世界卫生组织（WHO）在其真菌优先病原体清单（FPPL）中列为“关键优先组”，强调由于唑类耐药性上升需要全球研究和行动。在该物种中，耐药机制涉及多种因素，包括共感染和基因如MDR1、CDR1和ERG11的过表达。在厄瓜多尔，很少有研究评估白色念珠菌的流行率和抗真菌敏感性。这项研究是首次使用RT-qPCR评估来自瓜亚基尔主要三级医院各种来源的53个临床样本中这三个关键基因的基础表达。

我们对绝对基因表达水平的研究显示，73.58%（n = 40）的白色念珠菌分离株表达了所有三种耐药相关基因（MDR1、CDR1和ERG11）。只有一株分离株（#18, DCA42）未检测到这些基因的表达，并且对氟康唑不耐药（补充表1）。虽然基因表达本身不能在没有体外测试（如确定最小抑制浓度MIC）的情况下确认耐药性，但先前的研究表明，这些基因的过表达显著促进唑类药物耐药性。在评估的基因中，ERG11是最常表达的（n = 49/53分离株），其次是CDR1（n = 45/53）和MDR1（n = 42/53）。这些结果与诸如Maheronnaghsh等人的研究不同，后者发现MDR1是耐药分离株中最常表达的，其次是CDR1。然而，我们的发现得到Rosana等人和Monroy-Pérez等人的报告支持，他们记录了在氟康唑耐药分离株中强烈的ERG11和CDR1表达。总体而言，这些差异突出了唑类耐药中基因表达模式的复杂性以及人群特异性监测的重要性。

CDR1过表达已成为白色念珠菌临床分离株中唑类耐药的关键机制。我们的结果显示，在45株分离株中，CDR1基因的平均表达最高（7.12E + 04），其中来自阴道分泌物样本的分离株#32 (DCA70)显示最高表达水平并确认对氟康唑耐药（图2，补充表1）。白色念珠菌是外阴阴道念珠菌病的主要原因，影响全球高达三分之二的女性。其他研究同样报告了阴道分离株中CDR1表达升高及其与增加致病性和耐药性的关联。研究还表明，氟康唑耐药分离株中CDR1表达增加与较高耐药性相关，并且抑制CDR1、CDR2和MDR1基因可以增强唑类敏感性，强调了CDR1基因在耐药机制中的关键作用。

白色念珠菌中的唑类耐药性与ERG11过表达或突变相关。在本研究中，92.45%（n = 49/53）的分离株显示ERG11表达升高，分离株#31 (DCA60)显示最高水平（3.02E + 05）（图2C）。ERG11具有第二高的平均表达（平均 = 5.20E + 04），与报告其过表达与降低唑类敏感性相关的报告一致。Rojas和Morais的研究同样记录了在耐药菌株中频繁的ERG11过表达，特别是在氟康唑暴露后。然而，Zare-Bidaki在敏感分离株中也观察到ERG11上调（仅与耐药表型比较），表明跨研究表达水平的可变性。

MDR1过表达也被确定为唑类耐药的重要贡献者。MDR1的失活降低毒力，而其过表达可能导致耐药性。我们的结果显示，77.36%的分离株（n = 41/53）表达MDR1高于对照水平，分离株#30 (DCA45)显示最高表达（6.47E + 05）（图2A）。尽管CDR1显示较高的平均表达（7.12E + 04），但MDR1在所有分析的基因中达到最高最大表达（1.69E + 04）（图2）。这些发现与先前报告MDR1经常与其他耐药基因过表达贡献于外排泵机制的研究一致。跨研究基因表达的差异可能源于不同的氟康唑浓度。然而，MDR1在其他念珠菌属中的相对表达在氟康唑不敏感分离株和那些对氟康唑敏感的分离株之间可能没有显著差异。

然而，当一起分析我们的结果时，观察到ERG11、CDR1和MDR1基因的基础过表达并不一致地与氟康唑耐药表型相关。先前的研究指出了这种缺乏相关性；Xu等人报告ERG11在临床分离株中既可能上調也可能下調，与耐药性没有直接关系。此外，尽管CDR1已广泛涉及唑类耐药性，但其过表达也在敏感菌株中检测到，表明可能是一种适应性而非因果功能。就MDR1而言，尽管其过表达已与某些分离株中的耐药性相关，但也在敏感菌株中有记录。此外，Xu等人仅鉴定了四株具有升高MDR1水平的耐药分离株，而其余显示水平降低。在我们的研究中，大多数临床分离株显示这三种基因的基础过表达，无论其敏感性谱如何。在鉴定的两株耐药分离株（#31和#41）中，均来自阴道分泌物，只有分离株#31显示ERG11显著过表达，可能涉及此耐药性的基因，而分离株#41显示水平与敏感分离株的平均值相当。这些发现强化了抗真菌耐药性在白色念珠菌中是多因素的，并不 exclusively 依赖于经典耐药相关基因的过表达的观点。

Fisher精确检验显示基因表达水平（MDR1、CDR1和ERG11）与样本来源之间无显著相关性。尽管如此，尿液样本显示MDR1（33.33%）、CDR1（26.67%）和ERG11（30.61%）过表达的最高频率。呼吸道分泌物排名第二，MDR1（21.95%）、CDR1（26.67%）和ERG11（24.49%）显示类似的升高表达，尤其是在CDR1内。此外，血培养和阴道分泌物在ERG11过表达中共享第三位（14.29%）。Avcioglu等人在土耳其重症监护室（ICU）进行的一项相关研究发现，念珠菌尿路感染患者的类似百分比（38%），具有高死亡率（76%）、升高血流（50%）和导管相关（38%）感染。

由于其结构相似性，唑类药物经常导致该类药物内的交叉耐药性。Zhang等人发现大多数氟康唑耐药白色念珠菌菌株也对伊曲康唑和酮康唑显示耐药性。在厄瓜多尔，Orellana和Pacheco报告了阴道分离株中对咪康唑（19.9%）、伊曲康唑（16.9%）和氟康唑（14%）的耐药性。Rodríguez发现大多数白色念珠菌分离株对氟康唑、伏立康唑和克霉唑保持敏感，尽管注意到对氟康唑（23.4%）和伏立康唑（10%）的耐药性。然而，全球趋势研究，如Feng等人，报告了甚至更高的氟康唑耐药率（52.94%）。此外，制霉菌素在厄瓜多尔显示出高敏感性（97.4%），尽管Nú?ez报告了从阴道分泌物分离的白色念珠菌中对氟康唑（72%）和制霉菌素（55%）的耐药性。

本研究初步评估了厄瓜多尔临床白色念珠菌分离株中关键基因（MDR1、CDR1和ERG11）参与氟康唑耐药性的基础表达，具有显著的过表达，特别是在尿液样本中。这些发现与由于基因过表达导致唑类耐药性增加的全球趋势一致，强调需要基于基因表达谱优化抗真菌治疗策略。然而，本研究有几个局限性，如样本量小、集中采样不具国家代表性、仅考虑氟康唑耐药性且缺乏17株分离株的耐药谱信息。然而，将它们纳入基础表达分析提供了临床分离株中耐药基因表达背景分布的见解，无论表型耐药状态如何。本研究的局限性表明，未来研究应侧重于全基因组测序和扩展的基因表达分析。在厄瓜多尔医院中，定期敏感性测试和持续监测对于改善患者结局至关重要。关于耐药机制分子分析的进一步研究对于制定有效治疗方案和应对耐药念珠菌菌株的全球传播至关重要。