原花青素对鱼类寄生虫多子鱼虱（Ichthyophthirius multifiliis）的抗寄生虫效果：体内实验与体外实验

《Apunts Sports Medicine》：Antiparasitic efficacy of procyanidins against the fish parasite, Ichthyophthirius multifiliis: In vivo and in vitro

　　本研究系统评估了花青素对淡水鱼白斑病病原体多毛口虫（Ichthyophthirius multifiliis）的体外和体内抑制效果。体外实验表明花青素对寄生虫的EC50分别为：滋养体0.10 mg/L，原虫2.99 mg/L，虫体4.65 mg/L，且可诱导虫体纤毛破坏和线粒体损伤。体内共培养实验显示，8 mg/L花青素处理组感染强度较对照组降低52.3%，并显著提高实验鱼存活率。急性毒性测试显示96小时LC50为30.22 mg/L，证实其安全性。该研究为开发新型天然抗寄生虫剂提供了实验依据。

　　

杨浩|沈宇航|孟有志|郑春茹|顾泽茂

华中农业大学渔业学院，武汉430070，中国

摘要

Ichthyophthirius multifiliis是一种全球分布的病原性纤毛虫，会导致淡水鱼出现白点病，给水产养殖业带来严重的经济损失。在本研究中，我们探讨了天然产物原花青素对I. multifiliis的体外和体内抑制效果。实验结果表明，原花青素表现出显著的抗寄生虫活性，在浓度为0.20 mg/L、4.00 mg/L和8.00 mg/L时，分别能够使滋养体（theronts）、原胞体（protomonts）和后胞体（tomonts）100%死亡，其有效浓度中位数分别为0.10 mg/L、2.99 mg/L和4.65 mg/L。从形态学上看，原花青素处理后I. multifiliis发生了显著变化，包括纤毛结构破坏和大量细胞质空泡的形成。透射电子显微镜观察发现，原花青素可导致寄生虫纤毛脱落，并引起严重的线粒体损伤和空泡化。体内实验中，我们通过共饲养实验研究了原花青素（0、1、2、4和8 mg/L）对患病金鱼与健康金鱼之间鱼虱病传播的影响。第4天时，患病鱼的感染强度为158.51至211.78 ind/cm²，各组间无显著差异；而第8天时，健康金鱼对照组的感染强度为165.14 ind/cm²，而在2.0 mg/L、4.0 mg/L和8.0 mg/L处理组的感染强度分别降至79.88、62.56和24.66 ind/cm²。急性毒性测试显示，原花青素对金鱼的96小时半数致死浓度为30.22 mg/L。这些发现表明原花青素是一种潜在的安全有效化合物，可用于防治鱼虱病。

引言

Ichthyophthirius multifiliis是一种高度致病的原生动物纤毛虫，可感染多种淡水鱼类，导致水产养殖业遭受重大经济损失（Coyne等人，2011年；Yang等人，2023a）。该寄生虫的生活周期包括四个主要阶段：具有感染性的滋养体、寄生性的营养体、自由游动的原胞体以及繁殖后的后胞体（Tange等人，2020年）。滋养体侵入易感宿主的上皮组织后转化为营养体，以宿主组织为食并生长至近1毫米直径；成熟的营养体会离开宿主进入自由游动的原胞体阶段，随后原胞体在适宜的基质上形成囊泡并繁殖出数百到数千个滋养体（Matthews，2005年；Yang等人，2023b）。I. multifiliis的感染会导致淡水鱼组织严重受损，引发鱼虱病（又称“白点病”）。由于其高发病率和死亡率，鱼虱病常被称为淡水鱼的“癌症”。因此，预防和控制鱼虱病已成为水产养殖研究和实践中的关键课题。

天然植物富含具有抗寄生虫特性的生物活性化合物，近年来在水产养殖疾病控制领域受到越来越多的关注。迄今为止，已有许多植物提取物被证实对I. multifiliisPsoralea corylifolia中的异补骨脂素和补骨脂素（Song等人，2015年）、Cynanchum atratum中的cynatratoside-C（Fu等人，2014年）、Magnolia officinalis中的木兰醇（Song等人，2018年）、Zingiber officinale中的10-姜辣素（Fu等人，2019年）以及Sargentodoxa cuneata中的表儿茶素没食子酸酯（Hu等人，2023年）。其中一些化合物在低浓度下就表现出显著效果，例如cynatratoside-C和表儿茶素没食子酸酯，在浓度低于0.3 mg/L时即可杀死所有自由生活的滋养体（Fu等人，2015年；Hu等人，2023年）。这一浓度远低于一些常用化学药物的剂量要求——例如甲醛需要80 mg/L的浓度，氯化钠则需要3 g/L才能达到有效控制效果（Mifsud和Rowland，2008年；Picón-Camacho等人，2012年；Forwood等人，2014年）。这些发现凸显了天然植物作为筛选和开发抗原生动物化合物以对抗I. multifiliis感染的宝贵资源。

原花青素是一类广泛存在于水果、谷物和蔬菜中的酚类化合物（Chu等人，2019年；Morazzoni等人，2021年）。结构上，原花青素是寡聚和聚合形式的黄烷-3-醇，其中通过C4→C8或C4→C6键连接的黄烷-3-醇单元被称为B型原花青素；若在C2和C7之间添加醚键，则称为A型原花青素（Xu等人，2015年；Williams等人，2015年）。这类化合物因其强大的抗氧化活性而广受认可，其活性超过了维生素C和E等常见抗氧化剂（Shi等人，2003年；Ge等人，2015年）。这一特性使它们在医药、功能性食品及日常化学品中得到广泛应用（Qi等人，2022年）。

在之前的筛选研究中，我们发现原花青素在低浓度0.2 mg/L下就具有显著的抗寄生虫活性（补充表S1）。因此，本研究旨在全面评估原花青素对I. multifiliis三个自由生活阶段的体外抑制效果：滋养体、原胞体和后胞体。同时，还评估了原花青素通过浸泡处理对I. multifiliis的体内治疗效果。这些数据为将其作为抗寄生虫剂在水产养殖中的应用提供了重要依据。

实验伦理声明

感染实验是在华中农业大学渔业学院的水生动物疾病预防与控制及绿色养殖实验室（武汉，中国）进行的。实验所用鱼类已获得华中农业大学机构动物护理和使用委员会的批准。

实验鱼类

实验用金鱼体重为3.4±0.7克，购自湖北省武汉市的一家宠物店。在感染实验开始前，

原花青素对不同阶段I. multifiliis的疗效

原花青素的化学结构如图2a所示。在0.2 mg/L浓度下，原花青素对滋养体表现出强效抑制作用，死亡率可达100%；在0.10 mg/L和0.05 mg/L浓度下，死亡率分别为42.97%和18.16%（图2b）。对照组中的滋养体形态正常，表面覆盖着大量纤毛；然而，在0.2 mg/L原花青素处理1小时后，出现了异常的空泡

讨论

本研究发现，天然产物原花青素在0.2 mg/L浓度下对滋养体具有显著的抗寄生虫效果。值得注意的是，原胞体和后胞体表面覆盖着密集的纤毛并具有厚实的细胞质膜，对杀虫药物通常较为耐药（Forwood等人，2014年；Yang等人，2023b）。我们的实验也证实了这一点，原花青素对原胞体和后胞体的有效浓度分别为5.0 mg/L和8.0 mg/L

结论

本研究表明，原花青素对I. multifiliis具有显著的抑制作用。体外实验中，原花青素对滋养体、原胞体和后胞体的EC₅₀浓度分别为0.10 mg/L、2.99 mg/L和4.65 mg/L。体内实验中，将金鱼浸泡在8.0 mg/L原花青素溶液中17天后，鱼虱病得到完全治愈，感染鱼的存活率提高了约30%。此外，原花青素对金鱼的96小时半数致死浓度为30.22 mg/L

作者贡献声明

杨浩：撰写——审稿与编辑、初稿撰写、方法设计、实验实施、数据分析。沈宇航：撰写——审稿与编辑、实验设计。孟有志：实验实施、数据分析。郑春茹：撰写——审稿与编辑。顾泽茂：撰写——审稿与编辑、资金筹集。

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。

致谢

本研究得到了CARS（CARS-46）专项基金和湖北省农业科技创新中心（2021-620-000-001-33）的支持。