靶向CXCR4+白血病细胞的人源化MMAE纳米偶联物在AML小鼠模型中的精准治疗研究

　　为解决急性髓系白血病(AML)因CXCR4高表达导致的化疗耐药和高复发难题，研究人员开发了人源化纳米偶联物T22-HSNBT-H6-MMAE。该药物通过靶向CXCR4+细胞精准递送细胞毒性载荷MMAE，在体外和体内实验中均展现出显著抗白血病活性，可完全抑制白血病扩散并延长生存期，且无系统毒性，为AML靶向治疗提供了新策略。

　　

急性髓系白血病(AML)是一种具有高度侵袭性的血液系统恶性肿瘤，其特征是异常髓系细胞的克隆性扩增。尽管近年来靶向治疗取得了一定进展，但由于高复发率和难治性疾病的存在，AML患者的总体生存率仍然不容乐观。这种治疗困境主要源于白血病干细胞(LSCs)的持续存在——这些细胞具有自我更新能力，能够抵抗化疗并发生克隆多样化，最终驱动疾病向更侵袭性的形式发展。特别值得关注的是，约50%的AML患者存在CXCR4的过表达，这与不良预后、化疗耐药和高复发率密切相关。

CXCR4作为C-X-C趋化因子受体4，在LSCs的运输和生存中扮演着关键角色。CXCR4与其配体CXCL12的相互作用对于LSCs在保护性骨髓微环境中的归巢和滞留至关重要。更重要的是，在化疗压力下，AML细胞会进一步上调CXCR4表达，这表明表面CXCR4的上调是化疗耐药的重要机制。面对这一挑战，研究团队开发了新一代人源化纳米偶联物T22-HSNBT-H6-MMAE，旨在实现对CXCR4⁺白血病细胞的精准靶向治疗。

这项发表在《Biomedicine》上的研究采用了多项关键技术方法：首先利用人源化nidogen衍生的HSNBT蛋白支架构建靶向纳米载体；通过位点特异性半胱氨酸偶联技术将可裂解连接子VC-PAB-MMAE连接到纳米载体上；采用流式细胞术评估CXCR4膜表达水平；通过XTT细胞活力测定和Annexin V/PI凋亡检测分析体外抗肿瘤活性；建立CXCR4⁺ AML小鼠模型进行体内疗效评估；使用免疫组化和组织病理学分析评估白血病浸润和毒性效应。

研究结果显示，在CXCR4靶向人源化纳米偶联物的结构与表征方面，T22-HSNBT-H6是一种30.3kDa的人源化CXCR4靶向硫载体蛋白，包含N末端T22肽(高度选择性的CXCR4配体)、人源nidogen衍生的HSNBTβ-桶状蛋白支架以及C末端多组氨酸标签。通过位点定向半胱氨酸偶联方法，成功将MC-VC-PAB-MMAE连接到T22-HSNBT-H6上，形成的纳米偶联物自组装成平均尺寸为16.6±1.5nm的寡聚纳米颗粒。

在纳米偶联物对CXCR4⁺ AML细胞的细胞毒性效应研究中，研究人员评估了四种不同CXCR4表达水平的AML细胞系：THP-1、SKM-1和OCI-AML-3(高CXCR4表达)以及MONO-MAC-6(中等受体表达)。体外细胞毒性试验表明，具有高CXCR4表达的OCI-AML-3、SKM-1和THP-1细胞对纳米偶联物表现出更高的敏感性。竞争实验证实，使用CXCR4拮抗剂AMD3100预处理可有效阻断纳米偶联物通过CXCR4的内化，几乎完全抑制其细胞毒性效应。

在有丝分裂灾难后继发凋亡的机制研究中，研究人员通过DAPI染色、细胞周期分析和Annexin V/PI检测等多种方法证实，T22-HSNBT-H6-MMAE主要通过诱导有丝分裂灾难(MC)继而引发凋亡来发挥细胞毒性作用。暴露于30nM T22-HSNBT-H6-MMAE的THP-1细胞在15小时后有丝分裂灾难显著增加，24小时后凋亡细胞百分比显著上升。细胞周期分析显示G2/M期阻滞，表明MMAE释放到细胞质中干扰了微管动力学。免疫组化分析进一步证实了组蛋白H2AX磷酸化(γH2AX)和caspase-3裂解的增加。

在体内抗肿瘤效果评估中，研究人员建立了CXCR4⁺ AML小鼠模型，通过生物发光成像(BLI)监测白血病传播。结果显示，5mg/kg剂量的T22-HSNBT-H6-MMAE治疗完全抑制了白血病传播，所有治疗小鼠在整个治疗期间保持无病状态。纳米偶联物治疗使小鼠的平均生存时间延长至38.5±1.27天，比对照组(14.6±0.15天)延长了2.62倍。重要的是，单独的纳米载体T22-HSNBT-H6(无偶联药物)在体内没有表现出抗肿瘤效果，表明抗肿瘤效果确实源于MMAE的靶向递送。

通过免疫组化评估白血病传播抑制，研究人员使用抗人CD45和抗人CXCR4抗体进行组织染色。结果显示，T22-HSNBT-H6-MMAE治疗组小鼠的骨髓、脾脏、肝脏和肺脏中均未检测到hCD45⁺细胞，而对照组这些器官中都有显著的白血病细胞浸润。这表明纳米偶联物治疗能够有效阻断AML在主要器官中的浸润。

在毒理学评估方面，组织病理学、生化和血液学分析显示，T22-HSNBT-H6-MMAE治疗没有引起明显的毒性效应。所有研究器官的H&E染色未发现与治疗相关的病理学改变。肝功能指标(AST、ALT)和肾功能指标(肌酐、尿素)与健康小鼠相当。血小板计数在治疗组中保持正常，且未观察到中性粒细胞减少——这是MMAE治疗常见的不良反应。

研究人员还评估了纳米偶联物在高白血病浸润AML模型中的效果。即使在白血病细胞已经大量浸润骨髓的情况下开始治疗，T22-HSNBT-H6-MMAE仍能显著减少白血病负荷并抑制传播。治疗组小鼠的平均生存时间延长至34.25±3.12天，比对照组(14.50±0.29天)延长了2.36倍。流式细胞术分析证实，纳米偶联物治疗显著降低了骨髓中白血病细胞的浸润。

最后，研究人员评估了纳米偶联物对CXCR4⁺ AML患者细胞的细胞毒性效应。研究纳入了12例AML患者的骨髓样本和4例健康供者的外周血单核细胞(PBMCs)。根据CXCR4表达水平，患者样本被分为高、中、低表达组。结果显示，纳米偶联物对高和中CXCR4表达的AML样本表现出强大的抗肿瘤活性，而对低CXCR4表达的样本(包括健康供者样本)则不敏感。健康PBMCs的活力在所有浓度下均保持在80%以上，表明纳米偶联物在测试浓度下对健康PBMCs没有显著毒性。

研究结论表明，T22-HSNBT-H6-MMAE作为一种新型人源化纳米偶联物，能够高效靶向递送强效抗有丝分裂药物MMAE到CXCR4⁺白血病细胞，用于AML治疗。该纳米偶联物通过诱导有丝分裂灾难和凋亡发挥细胞毒性作用，且在体内实验中显示出强大的抗肿瘤活性，能够完全抑制白血病在骨髓和髓外部位的传播，显著延长生存期而不引起系统性毒性。值得注意的是，纳米偶联物即使在白血病细胞大量浸润骨髓的情况下仍能有效抑制白血病负荷，这表明它特别针对骨髓中驻留的AML细胞，包括白血病干细胞(LSCs)。

这项研究的重要意义在于，T22-HSNBT-H6-MMAE具有广泛的治疗窗口、人源化特性、强大的细胞毒性效应和最小毒性，能够选择性靶向CXCR4⁺白血病细胞(包括LSCs)，使其成为有前景的临床转化疗法。其靶向CXCR4的人源化特性为预后不良的广泛患者群体提供了量身定制的治疗选择，使其成为临床环境中靶向医学的有前途的治疗工具。未来需要进一步确定能够从这种治疗方法中获得卓越临床效益的患者群体。