综述：生物偶联的最新进展：从策略设计到临床应用

　　本综述系统回顾了生物偶联技术（Bioconjugation）的最新进展，涵盖传统与新兴策略（如生物正交点击化学、ADC、PEGylation等），重点分析其在药物递送（如抗体-药物偶联物ADC）、分子成像、诊断生物传感器及临床转化中的应用，并探讨了位点特异性、稳定性、免疫原性等关键挑战与未来发展方向。

　　

引言

生物偶联是指通过共价键将生物分子（如蛋白质、核酸、糖类或脂质）与其它功能实体（合成聚合物、荧光探针、药物分子等）进行连接的技术。自20世纪中期首次应用于蛋白质标记以来，该技术已发展成为抗体-药物偶联物（ADC）、分子成像、靶向递送系统和诊断生物传感器的核心平台。

生物偶联策略

生物分子反应基团与交联策略

生物偶联的成功依赖于对蛋白质、核酸、糖类和脂质中特定反应基团的精准利用。例如，蛋白质中赖氨酸的氨基和半胱氨酸的巯基是常见的修饰位点，可通过琥珀酰亚胺酯或马来酰亚胺等进行特异性偶联。核酸则常利用5′-磷酸或3′-末端二醇进行氧化后形成醛基，进而实现耦合。

零长度交联与无痕连接

该方法直接在生物分子间形成共价键，无需额外连接子组分。例如，胺与醛/酮反应生成亚胺，再经氰基硼氢化钠还原为仲胺；羧酸则可通过碳二亚胺活化形成活性中间体，进一步与胺形成酰胺键。

同双功能和异双功能连接子

同双功能连接子（如二琥珀酰亚胺戊二酸酯，DSG）两端具有相同反应基团，适用于对称性偶联；而异双功能连接子（如SMCC）整合不同反应基团（如NHS酯与马来酰亚胺），可实现顺序或正交偶联，广泛用于抗体-药物偶联物（ADC）等复杂构建体的制备。

设计考量与稳定性

连接子的刚柔性、稳定性和生物相容性显著影响偶联物的功能。短烷基链连接子增强刚性，而聚乙二醇（PEG）类连接子提高亲水性和柔性，延长血液循环时间。可逆连接（如二硫键、硼酸酯）适用于刺激响应性药物释放，而不可逆连接（如酰胺键、硫醚键）则提供长期稳定性。

生物正交点击化学

生物正交点击化学反应具有高选择性、快速性和生物相容性，可在活体系统中进行而不干扰天然生物过程。主要包括：

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  铜催化的叠氮-炔环加成（CuAAC）：反应效率高，但铜催化剂具有细胞毒性，限制其体内应用；

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  应变促进的叠氮-炔环加成（SPAAC）：无需金属催化剂，适用于活细胞标记；

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  逆电子需求狄尔斯-阿尔德反应（IEDDA）：四嗪与反式环辛烯（TCO）间的反应速率极快，适用于实时成像与靶向释放。

其他重要反应还包括Staudinger连接、光点击化学、硫醇-烯/炔反应等，这些反应在活体标记、药物递送和成像中展现出广泛应用前景。

生物偶联的应用

药物递送与靶向治疗

生物偶联技术通过将治疗剂（如细胞毒素、siRNA、放射性核素）与靶向分子（抗体、肽类）或载体（纳米粒子）精确连接，实现疾病细胞的精准靶向。代表性药物偶联物包括：

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  抗体-药物偶联物（ADC）：如Kadcyla?（曲妥珠单抗-Emtansine），通过靶向HER2受体实现肿瘤特异性杀伤；

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  小分子-药物偶联物（SMDC）：如PSMA-617，靶向前列腺特异性膜抗原（PSMA），用于前列腺癌的诊断与治疗；

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  放射性核素药物偶联物（RDC）：如1??Lu-DOTATATE，用于神经内分泌肿瘤的治疗与成像；

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  siRNA偶联物：如Givosiran（Givlaari?），通过GalNAc靶向肝细胞，治疗急性肝卟啉症。

抗体相关应用

抗体偶联策略涵盖赖氨酸、半胱氨酸、工程化半胱氨酸（Thiomab?）、非天然氨基酸（uAA）和糖基化位点等多种方式。ADC设计中的关键因素包括抗体选择、连接子稳定性和药物抗体比率（DAR），这些因素直接影响药代动力学和治疗效果。目前已有14种ADC获FDA批准，用于治疗乳腺癌、淋巴瘤等恶性肿瘤。

免疫治疗与疫苗开发

结合疫苗（如Hib、PCV13）通过将多糖抗原与蛋白质载体（如破伤风类毒素）偶联，增强免疫原性，尤其对婴幼儿效果显著。近年来，偶联技术也应用于病毒疫苗开发，如基于RBD-破伤风类毒素的SARS-CoV-2疫苗（Soberana 02）。此外，生物偶联在肿瘤免疫治疗中通过连接肿瘤相关抗原（TAA）与免疫刺激分子（如TLR激动剂），增强抗肿瘤免疫应答。

聚乙二醇化（PEGylation）

PEGylation通过将PEG共价连接到治疗剂（如蛋白质、核酸、脂质体），改善其药代动力学特性、稳定性和生物相容性，降低免疫原性。代表性药物包括Pegasys?（聚乙二醇干扰素α-2a）、Doxil?（聚乙二醇化脂质体多柔比星）及COVID-19 mRNA疫苗中的PEG化脂质纳米颗粒（LNP）。

偶联探针与生物传感器

偶联探针（如荧光标记、生物素- streptavidin系统）广泛应用于分子检测、成像和诊断。生物传感器通过将生物识别元件（酶、抗体、核酸）与物理化学传感器偶联，实现葡萄糖（如连续血糖监测系统CGM）、病原体（如SARS-CoV-2快速检测）和癌症标志物（如CEA、PSA）的高灵敏度检测。

生物仿生材料与纳米技术

生物偶联技术用于开发功能化纳米材料（如脂质体、金纳米粒子、量子点、DNA纳米结构），这些材料在靶向给药、分子成像、诊断和治疗中发挥重要作用。例如，金纳米粒子偶联抗体用于侧流免疫检测，量子点偶联肽类用于肿瘤手术中的实时成像。

标记技术与糖偶联物

核酸标记（如荧光染料、同位素）、生物素化、荧光标记（如FITC、Cy5）和同位素标记（如???Tc、12?I）等技术为分子生物学研究和临床诊断提供重要工具。糖偶联物（如结合疫苗、糖蛋白药物）通过酶促、化学或代谢方法制备，应用于疫苗开发、靶向治疗和再生医学。

临床挑战与未来方向

尽管生物偶联技术取得显著进展，其临床转化仍面临诸多挑战，包括合成复杂性、免疫原性、药代动力学限制、规模化生产和监管要求。未来发展方向包括：

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  开发智能响应系统（如刺激响应性连接子）；

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  整合人工智能与高通量筛选优化连接子设计；

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  拓展靶向蛋白降解（TPD）策略，如PROTAC、LYTAC等；

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  推动多功能纳米平台和个体化治疗应用。

通过跨学科合作与技术优化，生物偶联技术有望在精准医疗中发挥更大作用。