PD-1/LAG-3双特异性抗体YG-003D1、YG-003D2和YG-003D3的构建与功能比较研究

　　本研究系统比较了三种靶向PD-1和LAG-3的双特异性抗体（BsAbs）YG-003D1（Ab-ScFv格式）、YG-003D2（DVD格式）和YG-003D3（Knob-into-Hole格式）的结构、功能和药代动力学特性。研究发现，YG-003D3在可制造性、稳定性和药代动力学方面表现最佳，是临床开发的最有前景候选分子，为PD-1/LAG-3双特异性抑制剂的理性设计提供了关键参考。

　　

在肿瘤免疫治疗领域，免疫检查点抑制剂（Immune Checkpoint Inhibitors, ICIs）如抗PD-1（Programmed Cell Death Protein 1）抗体已展现出显著的临床效益，然而仍有大量患者对PD-1单药治疗无应答或产生耐药。研究表明，LAG-3（Lymphocyte Activation Gene-3）与PD-1在肿瘤浸润T细胞上共表达，且LAG-3的上调是PD-1阻断耐药的重要机制之一。因此，同时靶向PD-1和LAG-3的双特异性抗体（BsAbs）成为克服耐药性、增强抗肿瘤免疫的新策略。尽管PD-1/LAG-3双特异性抗体备受关注，但不同抗体格式的系统性比较仍较为缺乏，这限制了对这类分子优化设计的理性指导。

为解决这一问题，研究人员开展了一项系统研究，设计并比较了三种不同结构的PD-1/LAG-3双特异性抗体：YG-003D1（Ab-ScFv格式）、YG-003D2（DVD格式）和YG-003D3（Knob-into-Hole格式），旨在评估它们在结构、功能和药代动力学方面的特性，为优化双特异性抗体提供关键依据。该研究发表于《Biomedicine》杂志。

在研究过程中，作者主要采用了以下关键技术方法：通过哺乳动物表达系统（ExpiCHO-S?细胞）表达并纯化三种BsAbs；使用蛋白A亲和层析和高效液相色谱（HPLC）分析抗体纯度和聚集情况；利用生物层干涉技术（BLI）和酶联免疫吸附测定（ELISA）评估结合亲和力与阻断活性；通过流式细胞术分析抗体与细胞表面靶点的结合及阻断效果；采用人外周血单核细胞（PBMCs）和混合淋巴细胞反应（MLR）模型评估免疫激活能力；并利用C57BL/6小鼠进行药代动力学研究。所有人体血液样本均符合伦理规范并获知情同意，动物实验经北京药理毒理研究所动物伦理委员会批准。

研究结果部分主要包括以下内容：

3.1. BsAbs的制备与质量控制分析

通过SDS-PAGE和SEC-HPLC分析，YG-003D1、YG-003D2和YG-003D3均达到较高纯度，但YG-003D1存在明显聚集（单体含量70.51%）。YG-003D3的热稳定性（Tm=63.8°C）和抗聚集性（Tagg=66.1°C）最佳，且其表达产量显著高于其他两种格式。

3.2. 蛋白水平的功能表征

三种BsAbs均能有效结合PD-1和LAG-3，其中YG-003D1显示出最强的阻断活性，其EC₅₀值在PD-1/PD-L1和PD-1/PD-L2阻断中分别为12.93 nM和17.82 nM。所有抗体均通过N297A突变去除了Fc介导的ADCC效应。

3.3. BsAbs结合PD-1和LAG-3时的空间位阻评估

通过双抗原夹心ELISA和BLI sequential binding实验发现，YG-003D1因四价结构和空间分离设计，在同时结合双靶点时几乎无空间位阻，而YG-003D2由于结合域邻近而表现出一定位阻效应。

3.4. 细胞水平结合与阻断效能分析

在表达PD-1或LAG-3的293T细胞及人PBMCs上，三种BsAbs均显示剂量依赖性结合。YG-003D1在LAG-3/MHC-II阻断中表现最佳（EC₅₀=17.82 nM），YG-003D2在PD-1/PD-L1阻断中略优（EC₅₀=4.725 nM）。

3.5. BsAbs的交联能力

所有三种BsAbs均能通过同时结合PD-1和LAG-3促进细胞间交联，荧光显微镜和流式细胞术结果显示交联率在27.6%~31.3%之间，显著高于对照组。

3.6. BsAbs的免疫激活效应评估

在PBMC激活和MLR实验中，YG-003D3诱导的IFN-γ分泌最强，而YG-003D1和YG-003D3均能显著提升IL-2和IFN-γ水平，表明它们可有效逆转T细胞耗竭。

3.7. 药物代谢分析

在小鼠药代动力学研究中，YG-003D1和YG-003D3的半衰期分别为107小时和103小时，与IgG对照组（102小时）相当，而YG-003D2清除较快（半衰期50小时），表明DVD结构可能影响体内持久性。

讨论部分指出，YG-003D3（Knob-into-Hole格式）在可制造性、稳定性和药代动力学方面表现最佳，是最具临床转化潜力的候选分子；YG-003D1（Ab-ScFv格式）虽然功能活性最强，但聚集倾向和低表达量限制其应用；YG-003D2（DVD格式）则因结构导致的位阻效应在双靶点结合中表现较差。该研究不仅为PD-1/LAG-3双特异性抗体的优化设计提供了重要依据，也为双特异性抗体在肿瘤免疫治疗中的广泛应用提供了理论支持和实验基础。

综上所述，本研究通过系统性比较三种不同格式的PD-1/LAG-3双特异性抗体，揭示了结构对抗体功能、稳定性及药代特性的影响，强调YG-003D3作为优质候选分子的潜力，为下一代肿瘤免疫治疗药物的开发指明了方向。