靶向PD-L1的免疫细胞疗法在肺癌中的安全性与有效性评估：新型体外效价安全性测试平台的建立与应用

　　本研究针对当前缺乏用于评估现货型免疫细胞疗法（如CAR-NK）的综合性体外效价安全性测试（EST）平台的问题，开发了一种整合直接/间接细胞毒性及软琼脂形成实验的新型EST方法。研究人员通过构建靶向PD-L1的CAR-NK细胞，筛选出候选细胞系α-PD-L1-#2L5-NK，并在小鼠异种移植模型中验证其显著抑制肿瘤生长且无毒性效应的优异性能。该研究为免疫细胞疗法的筛选和质量控制提供了重要技术支撑，对推动标准化和监管体系建设具有关键意义。

　　

在肿瘤免疫治疗领域，嵌合抗原受体（CAR）修饰的T细胞疗法在血液肿瘤治疗中取得了突破性进展，然而其在实体瘤治疗中仍面临巨大挑战。自然杀伤（NK）细胞因其具有更强的肿瘤杀伤能力和更好的安全性特征，逐渐成为细胞治疗的新宠。特别是靶向程序性死亡配体1（PD-L1）的免疫检查点抑制剂已在多种癌症治疗中显示出临床效益，但总体响应率仍不理想。这就催生了将CAR技术与NK细胞相结合的新策略，即CAR-NK细胞疗法。

然而，这类新型疗法的临床应用仍存在两个关键瓶颈：一是缺乏能够全面评估细胞产品疗效和安全性的标准化体外测试平台；二是CAR-NK细胞可能存在脱靶毒性和细胞因子释放综合征等风险。传统的评估方法多侧重于直接细胞毒性，而忽视了间接杀伤效应和长期安全性问题。正是为了解决这些难题，韩国毒性研究所的研究团队开展了这项创新性研究，其研究成果发表在《Biomedicine 》上。

研究人员采用的主要技术方法包括：利用慢病毒载体系统构建第三代PD-L1特异性CAR结构（含CD28/DAP10/CD3ζ信号域），通过流式细胞分选技术建立单克隆CAR-NK细胞系；建立综合性的体外效价安全性测试（EST）平台，整合直接细胞毒性测定（WST-1法）、间接细胞毒性测定（条件培养基处理）和软琼脂克隆形成实验；使用人肺癌细胞系（A549、HCC44）和正常肺成纤维细胞系（IMR-90、MRC-5）作为靶细胞；通过异种移植小鼠模型（H460肺癌模型）进行体内疗效验证；并按照良好实验室规范（GLP）标准开展单剂量毒性研究，全面评估血液学、生化学和组织病理学指标。

3.1. Establishment of monoclonal α-PD-L1-NK cell lines

研究人员成功构建了靶向PD-L1的CAR-NK细胞系，该CAR结构包含抗PD-L1的单链抗体（scFv）、Myc标签、CD8铰链区以及CD28/DAP10/CD3ζ细胞内信号域。通过流式细胞分选技术，从29个克隆中筛选出三个具有低、中、高CAR表达水平的单克隆细胞系：α-PD-L1-#2L5-NK、α-PD-L1-#M5-NK和α-PD-L1-#H3-NK。这些细胞保持了亲本NK92细胞的表型特征，包括NKG2D、NKp30、NKp46等激活受体和NKG2A、KIR2DL2/3等抑制受体的正常表达。

3.2. Direct cytotoxicity of CAR-NK cells against PD-L1-expressing target cells

直接细胞毒性实验显示，α-PD-L1-#2L5-NK对PD-L1^High的肺癌细胞系HCC44和PD-L1^Low的A549细胞均表现出最强的杀伤效果，且在效应靶比（E:T）为1:1、共培养48小时条件下达到最佳分辨效果。值得注意的是，高CAR表达的α-PD-L1-#H3-NK对正常肺成纤维细胞（IMR-90和MRC-5）显示出最强的脱靶毒性，这表明CAR表达水平需要精确调控以平衡疗效和安全性。

3.3. Indirect cytotoxicity of CAR-NK cells by substances secreted for effector function

间接细胞毒性实验发现，CAR-NK细胞与癌细胞共培养24小时后的条件培养基能显著抑制癌细胞增殖，但对正常细胞影响较小。其中，α-PD-L1-#2L5-NK的条件培养基效果最为显著。细胞因子检测显示，α-PD-L1-#2L5-NK在共培养后分泌最高水平的干扰素γ（IFN-γ）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）和颗粒酶B（granzyme B），这解释了其强大的间接杀伤能力。

3.4. Inhibitory effect of CAR-NK cells on cell proliferation

软琼脂克隆形成实验证实，CAR-NK细胞本身无异常自我增殖能力，与癌细胞共培养后能轻微抑制癌细胞增殖，但对正常细胞增殖无影响。该实验为CAR-NK细胞的长期安全性提供了重要证据。

3.5. Efficacy and safety of α-PD-L1(#2L5)-NK92 in vitro evaluation experiments

通过创新的六边形图表评估系统，研究人员对三个CAR-NK克隆进行了综合效价安全性评分。α-PD-L1-#2L5-NK在效价方面得分最高（对癌细胞杀伤力最强），在安全性方面得分中等，综合表现最优，因此被选为后续体内实验的候选细胞系。

3.6. In vivo efficacy in a murine H460 xenograft model

在H460肺癌异种移植模型中，α-PD-L1-#2L5-NK治疗显著抑制了肿瘤生长和重量，相比对照组ΔEcto-NK具有统计学意义。

3.7. Absence of toxicological alterations in the in vivo toxicity assessment

单剂量毒性研究表明，α-PD-L1-#2L5-NK在BALB/c裸鼠中未引起死亡率、毒性反应或血液学、生化学参数的显著改变，组织病理学检查也未发现毒性改变，证明了其良好的安全性特征。

研究结论与讨论部分强调，本研究建立的体外EST平台能够全面评估CAR-NK细胞的效价和安全性，成功筛选出α-PD-L1-#2L5-NK这一具有最佳疗效安全性平衡的候选细胞系。该平台整合了直接细胞毒性、间接细胞毒性和长期增殖影响等多维度评估指标，通过六边形图表实现了可视化综合评价。

该研究的重要意义在于：首先，为解决现货型免疫细胞疗法缺乏标准化评估平台的难题提供了创新性解决方案；其次，建立的EST方法能够早期识别潜在安全风险，减少临床试验失败率；第三，研究证实了CAR表达水平需要精确调控，过高可能导致脱靶毒性，这为CAR设计提供了重要参考；最后，该平台可推广应用于其他靶点的CAR-NK细胞评估，对推动整个细胞治疗领域的标准化和监管体系建设具有重要价值。

研究人员也指出了研究的局限性，包括仅测试了单一PD-L1靶向的CAR结构，以及未全面评估CAR载体整合位点对细胞功能的影响。未来研究将扩展至其他靶点如CD19和HER2的CAR-NK细胞评估，并采用CRISPR/Cas9等基因编辑技术实现位点特异性整合，进一步提高CAR-NK细胞疗法的安全性和有效性。