综述：ZNRF2在肾缺血再灌注损伤中整合泛素化驱动的铁死亡和线粒体质量控制

　　本综述系统探讨了ZNRF2（一种RING型E3泛素连接酶）在肾缺血再灌注损伤（RIRI）中的核心作用。文章重点阐述了ZNRF2如何通过泛素化修饰整合铁死亡（Ferroptosis）敏感性（如调控GPX4、SLC7A11、NCOA4等关键蛋白）与线粒体质量控制（MQC）过程（包括DRP1介导的线粒体分裂、PINK1-Parkin线粒体自噬和mTORC1/TFEB轴调控的溶酶体清除），为理解RIRI发病机制提供了新的整合性框架，并展望了以ZNRF2为靶点的治疗策略（如小分子稳定剂、PROTACs等）及其干预时间窗，为开发新型靶向治疗策略开辟了道路。

　　

1. 引言

肾缺血再灌注损伤（RIRI）是指肾脏血流暂时中断后恢复灌注，反而加重组织损伤并损害器官功能的病理过程。它在肾移植、血管外科手术、创伤和多种急性肾损伤（AKI）中尤为常见，是导致移植肾功能延迟恢复和长期移植肾丢失的主要原因之一。当前临床管理策略效果有限，亟需深入探索其分子机制并寻找新的治疗靶点。

RIRI的病理特征包括氧化损伤、炎症反应、程序性细胞死亡激活以及线粒体和能量代谢障碍。其中，铁死亡（Ferroptosis）作为一种新发现的铁依赖性细胞死亡方式，以脂质过氧化为特征，显著区别于凋亡、坏死和自噬，已成为RIRI治疗研究的新焦点。同时，线粒体作为细胞能量工厂，在RIRI发病机制中扮演核心角色。缺血破坏线粒体电子传递和ATP合成，导致能量耗竭和活性氧（ROS）积累；再灌注后，损伤进一步加剧，诱导线粒体功能障碍并激活细胞死亡通路。

近年来，翻译后修饰尤其是E3泛素连接酶介导的泛素化被证实是细胞响应缺血应激的关键调控机制。泛素化通过将泛素分子共价结合到底物蛋白上，调控其稳定性、定位和活性，广泛参与细胞适应与生存机制。在众多泛素连接酶中，锌指与环指蛋白2（ZNRF2）因其在自噬调控、蛋白周转、信号转导和代谢稳态中的广泛作用而备受关注。然而，ZNRF2在RIRI中的具体功能仍不明确。其整合泛素化信号、铁死亡敏感性和线粒体功能障碍通路的独特潜力，使其成为一个极具前景的治疗干预靶点。

2. ZNRF2：结构、表达与分子功能

ZNRF2是RING型E3泛素连接酶家族成员，其C端含有特征性的RING结构域，负责招募E2泛素结合酶并催化泛素向底物蛋白的转移，从而决定泛素化信号的特异性。此外，ZNRF2还包含一个N端豆蔻酰化修饰位点，促进其定位于膜结构，以及一个中央锌指样结构域，可能介导蛋白质相互作用或维持结构稳定性。该蛋白结构在脊椎动物中进化保守，提示其在基础细胞过程中的重要功能。

亚细胞定位研究表明，ZNRF2主要位于细胞内膜系统如内体和溶酶体的胞质侧。这种膜结合特性使其能够与囊泡运输和溶酶体调控相关的信号复合物相互作用。值得注意的是，ZNRF2可与溶酶体上的mTORC1信号复合物组分结合，响应营养状态变化以影响mTORC1的激活，其调控可能通过调节Ragulator和v-ATPase的相互作用实现。

在转录水平，ZNRF2在多器官中表达，其中在脑、骨骼肌和肾脏中表达较高。蛋白质组学数据进一步证实其在肾小管上皮细胞中具有中高程度表达。在病理应激条件下，如内质网应激和氧化应激，ZNRF2的表达呈现动态变化，但其具体的转录调控机制尚不清晰。

功能上，除泛素化作用外，ZNRF2还参与细胞分化、膜运输和溶酶体酸化等过程。研究表明，敲低ZNRF2会延迟氨基酸饥饿后mTORC1的再激活，提示其参与营养感知和自噬相关信号通路。这些功能具有组织特异性。在肾脏损伤尤其是RIRI中，ZNRF2的确切生物学作用尚未经实验验证，但鉴于其在肾小管上皮细胞中的表达以及溶酶体和泛素化信号在RIRI中的重要性，ZNRF2很可能是介导应激响应蛋白降解、内溶酶体稳态或代谢适应的关键分子。

3. 泛素化：RIRI中细胞应激反应的关键调控者

泛素化是一种进化保守的蛋白质翻译后修饰形式，在调控蛋白稳定性、细胞内信号传导和细胞应激适应中发挥关键作用。该修饰由E1泛素激活酶、E2泛素结合酶和E3泛素连接酶协同催化完成，其中E3酶决定底物特异性。在RIRI中，经历缺氧与再氧合的急剧变化，泛素-蛋白酶体系统（UPS）起到关键的监控作用，清除异常或错误折叠的蛋白，精细调节应激响应信号。

多项研究揭示了特定泛素化事件在RIRI病理生理过程中的作用。例如，E3连接酶Parkin响应线粒体去极化而活化，并转位至受损线粒体，通过泛素化外膜蛋白促进线粒体自噬（Mitophagy）。TRAF6则介导K63连接的泛素化，促进NF-κB信号通路和炎症反应，二者均是RIRI的核心机制。CHIP（Hsc70互作蛋白C末端）通过靶向降解关键氧化还原蛋白调控氧化应激响应。

除调控炎症和凋亡外，泛素化在调节自噬和铁死亡这两个日益被认为与RIRI密切相关的过程中也至关重要。例如，NEDD4L可通过降解PTEN（磷酸酶与张力蛋白同源物）促进缺血后自噬流和肾小管细胞存活。SCF复合物的底物识别组件FBXW7则通过泛素化c-Myc或细胞周期蛋白E，在缺氧条件下介导细胞周期阻滞和凋亡。此外，HRD1和TRIM家族E3连接酶调控内质网应激和未折叠蛋白反应（UPR），与RIRI诱导的肾小管损伤密切相关。

值得注意的是，泛素信号不仅传递降解信号，还通过K63、K27或线性连接的泛素链介导非蛋白水解功能，调控DNA修复、炎症信号和细胞器质量控制等过程。这些过程的特异性既取决于参与的E3连接酶，也取决于所形成的泛素链类型。去泛素化酶（DUBs）如USP30和CYLD通过去除泛素链、恢复底物稳定性或改变下游信号输出，进一步精细调控这些通路。

尽管已有多种E3连接酶在RIRI中得到研究，但ZNRF2在该背景下的作用仍属未知。鉴于其溶酶体相关定位以及已报道的在调控内体运输和mTORC1活性中的作用，ZNRF2很可能在肾脏损伤期间参与泛素介导的溶酶体动力学、自噬流或应激信号调控。然而，目前尚无直接证据表明ZNRF2与特定的RIRI相关蛋白的泛素化存在联系。

4. 铁死亡：肾缺血再灌注损伤的新兴参与者

铁死亡是一种独特的受调控细胞死亡形式，以细胞内铁 overload、脂质过氧化和质膜破坏为特征，其发生独立于经典的凋亡或坏死性凋亡。其标志性机制是谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）的功能障碍——这是一种谷胱甘肽（GSH）依赖的酶，能将脂质氢过氧化物（L-OOH）解毒为相应的醇（L-OH）。在GPX4失活或GSH耗竭的条件下（如氧化应激时），脂质过氧化物会不受控制地积累，最终引发铁死亡性细胞 demise。

在RIRI背景下，铁死亡作为一种肾小管上皮细胞死亡的非经典机制日益受到关注。缺血破坏氧化磷酸化，而再灌注则突然重新引入氧气，导致ROS爆发。这些ROS不仅造成线粒体和DNA损伤，还促进细胞膜中多不饱和脂肪酸（PUFAs）的脂质过氧化，这是铁死亡的标志。肾脏近端小管代谢活跃且富含线粒体和PUFAs，因而对铁死亡性损伤特别敏感。

GPX4的活性在转录和翻译后水平均受到严格调控。在转录水平，GPX4的表达受Nrf2通路调控，该通路在缺血早期常被抑制。在翻译后水平，GPX4易通过泛素化降解，近期研究发现TRIM46和MIB1等E3连接酶在氧化应激下介导GPX4降解。相反，去泛素化酶如USP7可稳定GPX4并防止铁死亡。值得注意的是，其中一些E3连接酶也调控系统Xc? 逆转运体（SLC7A11和SLC3A2）的组分，该转运体负责摄入胱氨酸（GSH的前体）。

铁死亡的另一个核心轴心是铁代谢。细胞内铁通过Fenton反应催化过氧化氢生成羟基自由基（•OH），从而放大ROS介导的脂质损伤。转铁蛋白受体1（TFRC）促进铁摄取，而铁蛋白重链（FTH1）储存多余铁，铁转运蛋白（FPN）介导铁输出。铁蛋白自噬（Ferritinophagy）即通过货物受体NCOA4对铁蛋白进行自噬降解，已被证明在IRI期间增加不稳定铁池并使细胞对铁死亡敏感。值得注意的是，缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）也在缺血期间导致铁稳态失调，其与铁死亡的相互作用仍是研究热点。

线粒体代谢与铁死亡存在间接联系。虽然线粒体ROS并非铁死亡的起始事件，但线粒体功能障碍可能增强ROS产生和铁释放。在某些背景下，线粒体柠檬酸载体和电压依赖性阴离子通道（VDAC）已被认为与铁死亡敏感性有关。

泛素化在调控铁死亡中的作用正在不断扩大。E3连接酶不仅靶向GPX4和SLC7A11，还调控参与PUFA生物合成的酶，如ACSL4（酰基辅酶A合成酶长链家族成员4）和LPCAT3（溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶3），它们通过使膜磷脂富含易氧化的脂肪酰基链来促进铁死亡。NEDD4和WWP1等连接酶通过泛素依赖性降解SLC7A11加剧应激下的铁死亡。

目前，尚无直接证据证明ZNRF2在肾脏背景下的铁死亡中发挥作用。然而，基于其溶酶体定位及其在内体运输中的调控功能，我们推测ZNRF2可能间接影响铁死亡相关过程。系统Xc? 和TFRC这两个铁死亡的关键参与者都受到内溶酶体调控和泛素化介导的周转。可以设想，ZNRF2可能通过调节这些转运体的降解或再循环，从而间接影响胱氨酸摄取或铁稳态。此外，ZNRF2可能与mTORC1信号通路交叉，而mTORC1本身通过脂质代谢和自噬调控铁死亡敏感性。

5. 肾缺血再灌注损伤中的线粒体功能障碍

线粒体功能障碍是RIRI中的一个核心致病事件，导致细胞能量崩溃、氧化应激以及受调控的细胞死亡形式，包括凋亡、坏死性凋亡和铁死亡。作为高代谢活性细胞器，线粒体通过氧化磷酸化产生细胞内90%以上的ATP。缺血期间，缺氧使电子传递链（ETC）活动停止，导致还原性中间产物积累。再灌注后，突然的再氧合导致ETC复合物I和III处爆发性产生ROS。

过量的ROS不仅损伤线粒体蛋白、脂质和DNA，还诱导线粒体通透性转换孔（mPTP）开放，导致线粒体膜电位（ΔΨm）崩溃、线粒体肿胀、细胞色素c释放和内在凋亡通路激活。ΔΨm的崩溃损害ATP合成，进一步加剧能量衰竭和小管损伤。

线粒体动力学——即裂变（Fission）和融合（Fusion）过程——在RIRI中也严重紊乱。动力相关蛋白1（DRP1）是一种胞质GTP酶，被招募至线粒体并通过收缩线粒体外膜促进碎片化。适度的裂变有助于清除受损的线粒体片段，但过度或不受调控的裂变是有害的。DRP1在Ser616位点的磷酸化（由CDK1、PKCδ或ERK1/2等激酶催化）增强其线粒体招募，而在Ser637位点的磷酸化（由PKA催化）则抑制其活性。在RIRI中，平衡倾向于Ser616磷酸化，导致过度的线粒体碎片化和肾小管细胞死亡。

另一方面，融合蛋白如线粒体融合蛋白1/2（MFN1/2）和视神经萎缩蛋白1（OPA1）在RIRI期间下调或失活，导致线粒体网络形成受损和生物能量能力下降。在动物模型中，DRP1的遗传或药理学抑制或MFN2的激活可通过保护线粒体完整性来减轻RIRI。

线粒体质量控制（MQC）系统——包括线粒体自噬、生物发生和蛋白稳态——对于抵抗缺血再灌注诱导的损伤至关重要。线粒体自噬，特别是通过PINK1/Parkin通路，选择性清除功能失调的线粒体。在基础状态下，PINK1在健康线粒体中迅速降解。然而，线粒体去极化导致PINK1在外膜上积累，从而招募并激活E3连接酶Parkin。Parkin泛素化多种线粒体蛋白，促进被自噬适配器如p62识别并通过溶酶体清除。在RIRI中，由于持续的氧化应激和ATP耗竭，该通路受损。

近期研究也强调了泛素化在调控线粒体动力学和线粒体自噬中的作用。例如，Parkin、MUL1和MARCH5是线粒体E3连接酶，协调裂变/融合机器的周转。去泛素化酶如USP30通过去除Parkin生成的泛素链负向调控线粒体自噬。因此，泛素化与去泛素化之间的平衡决定了受损线粒体的命运。

ZNRF2虽然传统上不与线粒体调控相关，但可能间接影响这些通路。ZNRF2定位于溶酶体膜，并涉及mTORC1信号和內体运输的调控。鉴于线粒体自噬体与溶酶体融合以完成最终降解，ZNRF2可能通过调节溶酶体容量或自噬体的运输来影响线粒体清除效率。此外，虽然仅是推测，但ZNRF2可能通过泛素化调节线粒体裂变/融合调节因子的周转，类似于其他RING型E3连接酶。

6. ZNRF2作为核心整合者：在RIRI中连接泛素化、铁死亡和线粒体功能障碍

ZNRF2是一种膜相关的E3泛素连接酶，主要定位于内溶酶体系统。虽然其作用在溶酶体完整性、囊泡运输和mTORC1信号方面已得到部分探索，但新兴的兴趣集中在其作为细胞应激响应整合调节者的潜力上。鉴于泛素化、铁死亡和线粒体功能障碍在RIRI中的汇聚，ZNRF2可能作为调节这些相互关联通路的节点发挥作用。

从泛素化角度来看，ZNRF2包含一个保守的RING结构域，这是其E3连接酶活性所必需的，使其能够将泛素部分从E2结合酶转移至特定底物。在免疫细胞和神经元中的早期研究表明，ZNRF2可以调节膜蛋白周转和溶酶体定位。尽管其底物谱仍未完全确定，但其定位表明它在调节内体-溶酶体融合、受损细胞器降解和跨膜转运体再循环中发挥作用——这些过程与应激下的细胞存活紧密相关。

在RIRI中，越来越多的证据指向泛素依赖性调控铁死亡的重要性。系统Xc?、GPX4和ACSL4——这些铁死亡核心调节因子——都受E3连接酶介导的降解调控。ZNRF2凭借其溶酶体邻近性和推定的底物特异性，可能通过调节SLC7A11的再循环或降解，间接影响胱氨酸摄取或谷胱甘肽生物合成。此外，铁转运蛋白如转铁蛋白受体（TFRC）也经历泛素化介导的内吞作用和溶酶体降解，可能受到ZNRF2的调控，从而改变不稳定铁池和铁死亡敏感性。

同时，RIRI中的线粒体功能障碍因裂变失调、线粒体自噬缺陷和膜电位丧失而加剧。在此，ZNRF2可能与线粒体质量控制（MQC）系统交互。例如，自噬体-溶酶体融合——对完成线粒体自噬至关重要——依赖于协调的内体运输，而这是ZNRF2已知能够影响的过程。此外，ZNRF2可能通过直接或间接泛素化调节线粒体外膜蛋白（如DRP1或MFN2）的周转，尽管这仍是假设。其与mTORC1的相互作用（mTORC1是自噬的已知抑制者和线粒体生物发生的调节者）也表明其在应激期间决定线粒体命运的作用。

ZNRF2整合营养感知、氧化还原失衡和细胞器功能障碍信号的能力，使其成为RIRI中适应性响应的关键协调者。在氧化和代谢应激条件下，如缺血再灌注，ZNRF2可能动态控制底物降解、自噬流和膜运输，影响细胞是走向恢复还是铁死亡/线粒体性细胞死亡。

7. 局限性与争议

尽管新兴证据强调ZNRF2是RIRI中一个潜在的节点调节者，但仍需承认几个重要的局限性和争议。首先，在肾脏模型中的直接实验证据仍然稀缺，当前的大部分理解是从神经或癌症研究中推断出来的。其次，E3连接酶之间的功能冗余可能使解释复杂化：Parkin、MARCH5、MUL1和TRIM家族成员也能调节线粒体动力学和应激响应，而去泛素化酶如USP30则抵消泛素信号，可能掩盖或对抗ZNRF2的活性。第三，ZNRF2的作用可能具有情境和阶段依赖性，在再灌注早期短暂上调可能赋予适应性响应，但持续激活或下降则导致有害效应。最后，药理学挑战依然存在，因为选择性靶向E3连接酶存在脱靶效应和意外扰动泛素-蛋白酶体或自噬通路的风险。这些不确定性凸显了在进行更严格的体内验证、与其他E3连接酶的对比分析以及考虑将ZNRF2作为RIRI中可成药靶点之前仔细评估治疗窗口的必要性。

8. 靶向ZNRF2在肾缺血再灌注损伤中的治疗意义

鉴于RIRI的多因素性质，针对单一下游效应器的治疗策略往往效果不佳。ZNRF2凭借其假定整合泛素化信号与线粒体质量控制和铁死亡调控的能力，成为一个引人注目的上游靶点，具有同时调节多个致病轴的潜力。虽然ZNRF2的药理学调节剂尚未问世，但基于其分子特征和调控作用，可以设想几种治疗策略。

首先，调节ZNRF2的表达或活性可能影响关键铁死亡相关蛋白（如GPX4、SLC7A11和ACSL4）的周转，从而在氧化应激条件下赋予细胞保护作用。在缺血应激下稳定ZNRF2功能可能有助于保护胱氨酸进口和谷胱甘肽生物合成，抵抗铁死亡损伤。相反，过度的ZNRF2活性可能加剧保护性蛋白的降解，使平衡倾向于铁死亡性细胞死亡。

其次，ZNRF2在溶酶体运输和自噬流中的作用表明，操纵它可能增强线粒体清除并减少受损细胞器的积累。通过ZNRF2依赖性机制增强线粒体自噬可能减轻线粒体ROS产生、ATP耗竭和mPTP开放——这些都是RIRI发病机制的关键贡献者。促进溶酶体功能的药物，如TFEB激活剂或mTORC1抑制剂（如雷帕霉素），可能与ZNRF2信号协同作用以增强线粒体质量控制。

第三，鉴于ZNRF2可能参与mTORC1信号，调节其表达或与mTOR通路组分的相互作用可能提供一条间接途径来调节细胞代谢、应激响应和自噬。双重靶向ZNRF2和mTORC1可能为重新平衡应激肾上皮细胞中的合成代谢-分解代谢过程提供一种有前景的方法。

基因治疗手段，例如在肾小管中通过腺相关病毒（AAV）介导的ZNRF2过表达或沉默，可能为实验性治疗调节提供特异性和持久性。此外，在肾脏类器官或体内模型中使用CRISPR基因编辑可以阐明ZNRF2在治疗背景下的功能相关性。

从药物发现的角度来看，高通量筛选ZNRF2 E3连接酶活性或其与已知底物相互作用的小分子调节剂，可能开辟新的药理学途径。基于其RING结构域架构的结构引导设计，可能有助于开发变构调节剂或基于PROTAC的ZNRF2降解剂或稳定剂。

重要的是，针对ZNRF2的治疗干预必须考虑情境特异性效应。虽然抑制ZNRF2在急性RIRI中可能具有保护作用，但长期抑制可能破坏蛋白质稳态或自噬周转。因此，组织或损伤阶段特异性的调节策略将是必不可少的。

9. 结论与未来方向

RIRI是一个涉及代谢应激、氧化损伤、细胞器功能障碍和受调控细胞死亡的复杂病理过程。越来越多的证据支持铁死亡和线粒体功能障碍作为肾小管上皮细胞损伤的核心贡献者。这些过程的调控景观深受泛素依赖性信号的影响，尤其是通过E3泛素连接酶的作用。

ZNRF2，一种主要定位于内溶酶体膜的RING型E3连接酶，已成为这些损伤通路的一个有前景但尚未被充分探索的整合者。其分子特征表明它可能协调蛋白周转、溶酶体运输和潜在的线粒体质量控制。尽管将ZNRF2与铁死亡调节因子（如GPX4、SLC7A11）或线粒体蛋白（如DRP1、MFN2）直接联系起来的证据仍然有限，但其空间和功能特征为进一步的机制研究提供了逻辑基础。

本综述提出了一个概念框架，其中ZNRF2通过泛素化依赖性通路同时调节铁死亡敏感性和线粒体动力学。我们假定，ZNRF2通过影响内溶酶体降解、自噬流和细胞氧化还原稳态，可以作为RIRI中的节点应激整合者。

未来的研究应聚焦于几个关键方向以验证和扩展这一假设。首先，通过泛素组学和邻近标记技术鉴定肾小管细胞中的ZNRF2底物，对于定义其功能谱至关重要。其次，条件性遗传模型如肾小管组织特异性Znrf2敲除或过表达可以阐明其体内生理相关性。第三，使用先进的蛋白质组学方法解码ZNRF2相互作用网络，可以揭示参与自噬、线粒体动力学和铁死亡敏感性的关键调控伙伴。第四，针对ZNRF2的药物发现努力——无论是通过小分子、基于结构的抑制剂、PROTACs还是病毒载体介导的基因传递——可能为治疗干预提供新途径。最后，理解ZNRF2在RIRI各个阶段功能的时空特异性对于设计靶向的、阶段特异性的疗法至关重要。

总之，尽管ZNRF2在肾脏损伤研究中仍是一个相对新颖的角色，但其在蛋白质稳态、铁死亡敏感性和线粒体完整性中的多面作用，使其成为一个具有变革潜力的治疗靶点。揭示其机制不仅将加深我们对RIRI的理解，还可能为肾脏损伤和移植结局的治疗开辟新途径。