基于CRISPR/Cas12a的信号开启型侧向流动免疫分析法用于超灵敏、选择性及快速检测临床样本中的人乳头瘤病毒DNA

　　本刊推荐：为解决HPV16 DNA高灵敏度、低成本快速检测难题，研究人员开发了一种基于CRISPR/Cas12a和DNA探针杂交的新型侧向流动检测技术。该技术通过设计特异性ssDNA探针（b-G10A10）和纯DNA捕获系统（T40/C40），实现了0.2 copies/μL的检测限，无需抗体，具备信号开启特性，在临床样本中表现优异，为低资源地区宫颈癌筛查提供了突破性解决方案。

　　

人乳头瘤病毒（HPV）感染，尤其是高危型HPV16，是全球宫颈癌发病的主要诱因，每年导致大量女性死亡。尽管世界卫生组织推荐采用巴氏涂片、阴道镜检查和聚合酶链式反应（PCR）等方法进行HPV筛查，但这些技术存在明显局限性：PCR可能因非特异性扩增产生假阳性，且需要昂贵设备和较长检测时间；视觉检测方法则高度依赖操作者的经验和技能，主观性强。这些缺陷在资源匮乏地区尤为突出，因此亟需开发一种低成本、易操作、快速、高灵敏且特异的HPV检测平台，以满足现场即时检测（Point-of-Care, POC）的需求。

近年来，基于成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）的技术为微生物和病原体的快速、可靠及高灵敏度检测提供了新的解决方案。其中CRISPR/Cas12a系统在识别并切割特定双链DNA（dsDNA）后，可表现出非特异性反式切割（trans-cleavage）活性，即持续切割任意非目标单链DNA（ssDNA）。这一特性被用于信号放大，显著提高了检测的敏感性和特异性。尽管已有研究尝试将CRISPR/Cas12a与侧向流动检测（Lateral Flow Assay, LFA）结合，但这些方法多数仍依赖抗体-抗原相互作用，存在成本高、保质期短、结果判读不直观（信号关闭型）等问题，限制了其在低资源环境下的应用。

为此，研究团队在《Biosensors and Bioelectronics: X》上发表了一项创新性工作，开发了首款完全基于沃森-克里克DNA杂交、无需抗体、且具备“信号开启”特性的CRISPR/Cas12a侧向流动检测系统，用于HPV16 DNA的超灵敏快速检测。

该研究依托环介导等温扩增（LAMP）技术对HPV16 DNA进行预扩增，利用CRISPR/Cas12a的反式切割特性及其对不同碱基序列切割效率的差异（G序列最难被切割），设计了一种新型探针b-G10A10（biotin-GGGGGGGGGGAAAAAAAAAA）。该探针在Cas12a激活后，其A10部分被切割，而G10部分保留完整，从而分别与检测线（T线）上的C40探针和控制线（C线）上的T40探针通过杂交结合。结合链霉亲和素-金纳米粒子（SA-AuNP）显色，实现视觉或智能手机定量分析。研究还使用了临床宫颈拭子样本进行验证，所有程序均符合伦理审查要求。

3.1. 检测原理

本研究的关键创新在于利用Cas12a的反式切割效率差异：它对poly-G的切割效率最低，而对poly-C、poly-A和poly-T的切割效率较高。基于此，团队设计了双功能探针b-G10A10，其G10部分在任何情况下均难以被切割，而A10部分在HPV16阳性样本中被切割。检测线上固定有C40探针，用于捕获未被切割的G10部分；控制线上固定有T40探针，用于捕获未被切割的A10部分。该设计实现了纯DNA杂交捕获，无需抗体，降低成本并延长了保存期限。

3.2. 初步HPV16 dsDNA检测实验

初步测试显示，阴性样本仅控制线显色，而阳性样本（10⁴ copies/μL）在检测线和控制线均显色，且控制线颜色强度显著低于阴性样本，证实该设计可有效区分阴阳性结果。通过ImageJ软件分析色带峰面积，计算T/C比值，实现定量检测。

3.3. 参数优化

研究团队系统优化了多个实验参数，包括洗涤缓冲液的PBS浓度、Tween 20浓度、探针浓度、SA-AuNP体积、LAMP和CRISPR反应时间等。最终确定最优条件为：0.1 M PBS、0.1% Tween 20、2 μM b-G10A10探针、10 μM T40/C40捕获探针、2 μL SA-AuNP、30分钟LAMP及30分钟CRISPR反应时间。

3.4. 分析性能

在优化条件下，该传感器对HPV16 dsDNA的检测线性范围为1–10⁴ copies/μL，线性方程为T/C = 0.2171 log₁₀(浓度) + 0.4614（R2 = 0.9950），检测限低至0.2 copies/μL。灵敏度高于多数现有方法，且具备良好的重复性和稳定性。

3.5. 选择性、重现性与稳定性测试

该传感器对HPV16表现出高度特异性，对HeLa18、大肠杆菌、酵母和B族链球菌等潜在干扰物无交叉反应。存储稳定性测试显示，在4°C下保存30天，传感器性能变化不超过±5%。10次重复实验的变异系数（%RSD）为4.08，表明制备工艺具有良好的重现性。

3.6. 实际样本检测

使用来自Phramongkutklao医院的临床宫颈拭子样本进行验证，结果显示该传感器与凝胶电泳结果完全一致，所有5份阳性及3份阴性样本均被准确识别，证实其在真实场景下的适用性。

本研究成功开发了一种新型CRISPR/Cas12a侧向流动检测系统，首次实现纯DNA探针捕获、无抗体介入、“信号开启”型的HPV16 DNA超灵敏检测。其检测限低、特异性强、操作简便且成本低廉，非常适用于资源有限地区的宫颈癌筛查。尽管目前仍需将CRISPR反应液滴加于控制线进行短暂孵育，略显繁琐，但该设计在稳定性、重现性和临床适用性方面均表现优异。未来通过微流控技术整合LAMP与CRISPR反应步骤，有望进一步提升其便携性和自动化程度，推动该技术在分子诊断领域的广泛应用。