综述：男性不育中的个体化生物标志物

　　本综述系统探讨了男性不育生物标志物研究的最新进展，重点介绍了基因组学（AZF区域微缺失、CFTR突变）、蛋白质组学（HSPA2、ANXA2等）、代谢组学及表观遗传学（DNA甲基化、非编码RNA）在精准诊断与个体化治疗中的应用潜力，为突破传统精液分析（SA）的局限性提供了新视角。

　　

Abstract

男性因素约占不育病例的30%，在与女性因素结合时额外贡献20%的比例。因此，诊断、预测并制定创新策略以应对男性不育至关重要。男性不育的评估超越病史和体格检查，主要聚焦于精液分析（SA）和内分泌评估。SA评估多种宏观精液参数，如体积、pH、颜色和粘度。由于这些参数存在显著变异性，一系列补充性生物标志物随时间被引入。传统生物标志物在识别男性不育根本原因方面效果有限，这推动了对更易获取、成本效益更高且能预测生殖结局的标记物的探索。组学新兴领域，包括基因组学、蛋白质组学和代谢组学生物标志物，为男性不育的靶向诊断提供了一条有前景的路径。

Introduction

不孕症的定义为经过12个月规律、无保护的性关系后仍无法怀孕，估计影响15%的夫妇。男性因素在这些病例中占30%，并与女性因素结合时，额外贡献20%。因此，诊断、预测并确定解决男性不育的新策略至关重要。

除了病史和体格检查，男性不育的评估主要侧重于精液分析（SA）和内分泌评估。SA不仅测量宏观精液参数，包括体积、pH、颜色和粘度，还评估微观特征，如精子浓度、总活力、前向运动力和形态。

虽然精液分析是不育评估的关键要素，并且是面临不育夫妇男性生殖系统的主要评估之一，但它并非没有局限性。该测试表现出显著变异性，并且关于生育结局的预测准确性仅为中等。由于参考范围内的精液参数并不总是表示正常生育力，而超出这些限值的数值也不一定确认不育，因此SA本身并不是建立准确诊断的最精确方法。事实上，当体格检查、实验室评估和SA未能确定根本原因时，30%至40%的病例被归类为特发性男性不育。

除了当前体格和实验室评估的固有局限性外，SA结果可能受到各种生理因素的影响，包括禁欲时间、全身性疾病、医疗状况、生活方式因素（如饮食和身体活动）以及环境暴露。由于精液参数的巨大变异性，许多补充性生物标志物随时间被引入。生物标志物被定义为可量化、可测量的生物指标，作为特定疾病状况的参考。

几种生物标志物已被探索用于评估男性不育，包括抗精子抗体（ASA）测试、顶体反应测试、精子穿透试验、精子-透明带结合测试、透明质酸结合试验和DNA损伤分析。然而，尽管为建立可靠的男性不育生物标志物付出了巨大努力，但关于其临床适用性的研究发现仍然不一致。例如，研究表明，ASA的存在并不总是与自然受孕、宫腔内人工授精（IUI）、体外受精（IVF）或卵胞浆内单精子注射（ICSI）的妊娠率改变相关，这引发了对ASA作为男性不育生物标志物可靠性的质疑。

此外，尽管一些精子功能测试已显示出对精子受精潜力的显著预测能力，但其实际使用受到需要存活精子或卵子以及这些评估耗时且技术复杂的限制。尽管对生殖健康的关注日益增长，但仍然缺乏能够可靠且敏感地预测男性生育力的生物标志物。

传统生物标志物在识别男性不育根本原因方面的有限效力促使了对更易获取、成本效益更高且能预测生殖成功的指标的探索。随着人类基因组的测绘，遗传医学的关注日益增加，强调根据个体遗传构成量身定制的个性化治疗策略。组学新兴领域，包括基因组学、蛋白质组学和代谢组学生物标志物，为男性不育的靶向诊断方法提供了一条有前景的路径。

组学指的是高通量分析技术，能够全面研究特定分子群体，包括蛋白质、DNA、RNA和代谢物等。这些方法正日益应用于男科学，以增强对男性不育的理解。随着不断进步，组学技术及其衍生物为表征与男性生殖健康相关的基因、蛋白质、代谢物和表观遗传修饰提供了宝贵的见解。

Genomics

基因组学侧重于对生物体整个DNA序列的全面分析。1959年核型分析的应用导致在特纳综合征（以单条X染色体和缺少Y染色体为特征；XO）和克氏综合征（以两条X染色体和一条Y染色体为特征；XXY）中识别出遗传异常。核型分析是男性不育的主要诊断测试之一，并被美国泌尿外科学会（AUA）推荐用于严重少精子症（精子浓度低于500万/mL）和非梗阻性无精子症（NOA）患者。

男性不育遗传基础的第一个重大突破出现在1992年，随着Y染色体的克隆以及随后发现无精子因子（AZF）区域作为关键遗传标记。进一步研究揭示，特定的AZF亚区域在精子发生中扮演重要角色。AZFa区域的缺失导致USP9Y和DBY/DDX3Y基因的丢失，引起唯支持细胞综合征。AZFb缺失，移除RBMY1和PRY基因，导致精子发生完全停滞。虽然AZFc区域也包含对精子生产至关重要的基因，但该区域的微缺失通常允许部分精子发生，使受影响个体成为睾丸精子提取的潜在候选者。

先天性双侧输精管缺如（CBAVD）是一种影响约1%不育男性的疾病，由囊性纤维化跨膜传导调节因子（CFTR）基因突变引起，导致梗阻性无精子症。鉴于其遗传基础，基因组学在男性不育中的一个重要应用是作为检测CBAVD的筛查工具，有助于早期诊断和个性化治疗计划。

研究表明，染色体异常在不育男性中的频率高出8-10倍，影响约3%的少精子症患者和高达19%的无精子症个体。然而，一些研究表明染色体异常也可能存在于严重程度较低的少精子症男性中，这意味着当前的诊断阈值可能无法识别大量病例，特别是在不明原因不育的个体中。染色体异常甚至可能存在于SA正常的男性中，因为研究在0.02%的原发性不育和0.3%的继发性不育个体中检测到此类异常。这一发现表明，即使SA结果看起来正常，遗传因素也可能导致不育。

除了在不育男性中观察到的众所周知的性染色体异常外，研究人员还发现了染色体多态性变异的显著频率。这些遗传变异与受损的精子发生和男性不育相关，尽管其确切的生物学影响仍然知之甚少。

尽管在美国不是常规诊断测试，但荧光原位杂交（FISH）用于严重畸形精子症或少弱畸精子症病例，以检测精子中的染色体异常。此外，在复发性流产病例中，FISH通过检测非整倍体精子来识别减数分裂缺陷。自1990年代以来，该技术已应用于分析X、Y、13、18和21号染色体的精子非整倍性，这些染色体最常与自然流产相关。了解精子非整倍性的存在有助于患者咨询有关ICSI风险和可能需要的植入前遗传学检测（PGT）的风险。

研究还发现了几条染色体——特别是1、2、6、9、16和17——含有与不育和处理后精子活力差相关的冗余区域或多态性。这表明这些染色体区域可能包含对最佳精子功能至关重要的基因。

微阵列技术分析拷贝数变异（CNVs）、基因表达水平和单核苷酸多态性（SNPs），为识别男性不育中高度敏感和特异的遗传生物标志物提供了巨大潜力。由于数千个基因贡献于精子发生，全基因组分析的进步——包括比较基因组杂交（CGH）、高通量测序、下一代测序（NGS）和SNP阵列分析——使得检测可能影响生育力的细微遗传变异成为可能。这些方法在识别男性不育相关潜在生物标志物和候选基因方面已显示出效率和成本效益的前景。

在男性因素不育病例中，阵列CGH不仅检测到Y染色体微缺失，还发现了AZF区域之外的额外CNVs，包括Y染色体假常染色体区域的变异。值得注意的是，假常染色体区域1中SHOX（矮小同源盒）基因的拷贝数变异也与男性不育有关。

研究已确定了几种可能与男性因素不育相关的基因，包括USP8、UBD、EPSTI1和LRRC32，表明它们作为潜在生物标志物的作用。此外，在诸如PDE3A、EFCAB4B、COBL、ATP8A1、MASP1、PROK2、AHRR、MTHFR和UBE2B（小鼠rad6 DNA修复基因的同源物，其敲除已被证明会导致不育）等基因中观察到了各种与男性生育力相关的单核苷酸多态性（SNPs）。

为了识别与男性不育相关的高风险非同义SNPs（nsSNPs），研究人员采用生物信息学工具，允许对遗传变异进行计算机分析。例如，先前的研究已在DNAH1（V1287G, L2071R, R2356W, R3169C, R3229C, E3284K, R4096L, R4133C, A4174T）和DNAH17（C1803Y, C1829Y, R1903C, L3595P）中识别出高风险nsSNPs，这些变异被预测会降低蛋白质稳定性，并且主要发生在高度保守的氨基酸位置。

近年来，Okutman等人汇编了31个与精子发生异常或受精失败密切相关的基因列表。在此基础上，Cannarella等人更近期地识别了60个与生精失败相关的基因。

尽管不断有发现，但这些基因中的大多数仍然主要具有诊断意义，在将其转化为治疗男性不育的治疗靶点方面进展有限。然而，随着研究的进展，核型分析、FISH和基因测序可能使男性不育能够更好地分类为不同的表型亚组，可能为个性化治疗方法铺平道路。

Epigenetic

对DNA的表观遗传修饰，如DNA甲基化、染色质重塑、组蛋白修饰、复制时间和核小体定位，可以在不改变遗传序列的情况下影响细胞功能。精子细胞特别容易受到氧化应激的影响，并且活性氧（ROS）已被证明会触发精子DNA的表观遗传改变。

据信，精子中的组蛋白修饰、DNA甲基化和鱼精蛋白化可能在胚胎发育过程中调节基因表达中发挥作用。此外，一些研究表明这些修饰可能有助于增加流产风险。然而，使用表观遗传标记诊断男性因素不育仍然具有挑战性，因为它们的生物学效应可能很微妙甚至可以忽略不计，并且不同的表观遗传改变可能导致相似的不育表型。

例如，已发现protamine-1（PRM1）和protamine-2（PRM2）水平降低的精子更容易受到DNA损伤并表现出存活率降低。此外，在弱精子症男性中注意到较低的PRM1和PRM2 mRNA水平。这些男性中异常的鱼精蛋白化也与CREM基因的甲基化模式改变有关。

此外，H19基因的低甲基化和MEST以及SRNPN基因的高甲基化与男性不育有关。此外，特定基因组位点DNA甲基化的变化与受孕困难有关，并且DNA甲基化和基因转录的模式可能预测IUI和IVF的成功率。

DNA甲基化作为男性不育的生物标志物具有前景，因为它在整个精子发生过程中保持稳定，不像RNA转录和组蛋白修饰。然而，尚不清楚精子中的表观遗传修饰是直接导致不育或亚生育，还是这些变化反映了不同的潜在病理。

对少精子症男性DNA甲基化的研究显示了印迹基因甲基化模式的改变，特别是IGF2/H19和MEST。

转录后表观遗传调控也可能通过短链非编码RNA（sRNAs）（如microRNA）调节蛋白质合成，从而 contribute to 男性不育。精子sRNA在附睾成熟过程中的修饰与受精潜力、胚胎发育甚至后代表型有关。

有人提出，精子中的sRNA谱可能受到附睾体（epididymosomes）的影响，这些是膜结合的细胞外囊泡，携带sRNAs和蛋白质的复合物，影响附睾的管腔环境。

各种环境压力源已被证明会改变精子中的sRNA谱，可能通过在压力期间将修饰的sRNA包装到附睾体中，然后决定哪些sRNA被递送到成熟精子中。这一发现具有临床意义，因为它表明睾丸来源的精子可能避免改变sRNA的有害影响， potentially improving the outcomes of embryo fertilization and embryo phenotype.

Proteomics

蛋白质组学侧重于分析全部表达蛋白质的结构和功能，提供了超越基因表达本身的见解，因为基因的存在并不总是与其蛋白质表达相对应。蛋白质组成因细胞类型而异，使得蛋白质组学成为通过跟踪全局蛋白质变化和研究蛋白质相互作用来调查男性不育的有价值工具。

对精浆（SP）生物标志物的研究可以追溯到1940年代，尽管进展最初受到技术限制的约束。一个重大突破出现在1980年代，当时发现转铁蛋白（Sertoli细胞分泌的首批蛋白质之一）与生殖细胞结合。其在NOA和少精子症患者中的浓度显著低于生育对照组，突显了其在男性生殖健康中的重要作用。

SP蛋白质组学的一个关键进展发生在2004年，当时研究人员在健康个体的 pooled 样本中识别出42种 distinct 蛋白质，包括PSA、前列腺酸性磷酸酶和semenogelin。这一列表在2006年急剧扩大，当时Pilch和Mann在单个个体中识别出923种独特的SP蛋白质，标志着寻找男性不育潜在生物标志物的转折点。

质谱技术的进步显著提高了蛋白质识别的精确度、灵敏度和效率。这些方法有助于检测SP、精子膜、各种精子结构和线粒体中的蛋白质，同时还能够分析蛋白质-蛋白质相互作用网络，这可能掌握男性不育的关键见解。

许多研究探索了不同不育条件下的蛋白质组学谱，识别出与反复IVF失败、弱精子症、少弱畸精子症（OAT）、NOA、圆头精子症、畸形精子症、DNA碎片增加、ROS水平升高和临床精索静脉曲张相关的 distinct 蛋白质模式。

然而，使用精液蛋白质组学作为不育的生物标志物 presents challenges due to significant variability in semen composition, both among individuals and within the same individual over time, as well as the influence of environmental factors and post-ejaculatory physiological modifications.

尽管存在这些复杂性，精浆蛋白质组是一个动态且复杂的系统，由附睾、精囊、前列腺和尿道球腺的分泌物 enriched， further emphasizing its potential role in reproductive health assessment.

Huang等人进行了一项蛋白质组学分析，以研究生精受损个体睾丸间质液（TIF）的完整蛋白质谱。这项开创性研究确定了NOA患者中改变的蛋白质表达模式。值得注意的是，与 retrieval 不成功的患者相比，在精子 retrieval 成功的NOA患者中，与氧化还原过程相关的蛋白质更为活跃。研究人员 suggest that these findings provide insight into the physiological and pathological roles of specific proteins in sperm production regulation. 他们的研究 underscore TIF作为预测精子 retrieval 结果的生物标志物来源的潜力，并为旨在改善无精子症治疗策略的未来研究 lay the groundwork。

总的来说，这些结果突显了氧化应激在决定精子 retrieval 成功中的重要作用，表明在手术精子提取前减少睾丸氧化应激可能会提高 retrieval 率。

Intasqui等人对原发性和继发性不育男性的精子进行了蛋白质组学分析，确定了BAG6和HIST1H2BA作为男性不育的潜在生物标志物。此外，这些蛋白质在射精精子中的存在表明其在精子运动力中的作用。这一研究领域提供了对细胞外囊泡（EVs）在弱精子症（AS）中功能的更深入理解，并为发现新的不育生物标志物 holds promise。

通过蛋白质组学和生物信息学分析，研究人员提出膜金属内肽酶（MME）和序列相似性家族3（FAM3D）以及SP中的ROS水平可能作为可靠的男性不育诊断生物标志物。

一项对特发性少弱精子症男性SP的蛋白质组学研究揭示了关键蛋白质表达的 variations，包括糖基化附睾分泌蛋白E1（NPC2）、半乳糖凝集素-3结合蛋白（M2BP）和 lipocalin-1，为未来研究该病症的潜在机制提供了 foundation。

基于这些发现，研究人员 hypothesize that reduced NPC2 levels could interfere with sperm cholesterol efflux, impairing capacitation. 这一假说与先前将胆固醇调节与男性生育力联系起来的研究一致。

研究表明，SP中的HSPA2蛋白可能作为评估精子发生的宝贵生物标志物，特别是在隐匿精子症男性中。此外，它可能有助于预测辅助生殖技术（ART）的成功。

最近一项对不同运动力水平精子的比较蛋白质组学分析 revealed significantly lower concentrations of HSPA1L and HSPA9 in low-motility sperm。

此外，蛋白质组学 investigations have shown that SEMG1 and PSMB5 are downregulated in sperm samples from men who have or have not achieved pregnancy via ART, indicating their potential relevance in fertility assessment。

Annexin 2（ANXA2），一种钙依赖性磷脂结合蛋白，主要位于细胞的质膜和内体中。蛋白质组学研究 identified elevated ANXA2 levels in the SP of men experiencing primary and secondary infertility. 因此，研究人员 hypothesize that ANXA2 dysregulation in SP may interfere with sperm maturation, contributing to the production of immature sperm and, ultimately, male infertility.

Metabolomics

代谢组学侧重于分析细胞活动的代谢副产物。由于这些代谢物是基因表达的最终产物，它们可能比基因组学、蛋白质组学或表观遗传学更准确地反映生物体的实际表型。

氧化应激在触发精子表观遗传修饰中发挥作用，并有助于ROS的产生。ROS水平升高常见于不育男性，并且与精子形态异常、浓度和运动力降低以及DNA碎片增加有关。

Gilany等人进行了一项研究，利用拉曼光谱评估20名NOA个体的精液中的ROS，作为检测精子发生的一种手段。他们的方法成功区分了在睾丸精子提取（TESE）期间表现出 active 精子发生的患者和那些没有的患者。此外，它将TESE阴性患者分类为 distinct 亚组，包括生精功能低下、精子成熟停滞和唯支持细胞综合征。

在另一项研究中，Gilany等人对接受TESE的NOA患者的精浆进行了代谢组学分析。使用气相色谱-质谱（GC-MS）进行非靶向代谢组学分析，他们识别出 distinct 代谢模式，这些模式区分了精子 retrieval 成功的个体和未找到精子的个体。

研究人员正在探索精子发生的各种代谢副产物作为男性不育的潜在生物标志物。Zhao等人进行了一项使用GC-MS的研究，检查与特发性弱精子症相关的精子代谢物。他们的 findings revealed multiple metabolites that were either elevated or reduced, primarily affecting amino acid, energy, and nucleoside metabolism。

同样，Qiao等人通过GC-MS分析了SP，并识别出44种在SA正常但原因不明的不育男性中与生育个体相比表达改变的代谢物。这些变化大多数与氨基酸代谢有关。他们的代谢组学分析方法成功区分了82%的不育男性和生育对照组， leading them to propose this method as a potential diagnostic tool for idiopathic infertility。

不育症的代谢组学研究也探索了其在ART中的作用，检查了ART结局如何与卵泡液（FF）和胚胎培养液中的ROS水平相关。一项分析FF样本和ROS的研究 identified a connection between oxidative stress markers (-CH, -NH, -OH, and ROH) and pregnancy success。此外，对35个胚胎及其 spent 培养液的体外研究 revealed distinct hydroxyl modifications in embryos that successfully implanted compared to those that did not。

虽然需要进一步研究，但代谢组学在 uncovering 与男性生育力相关的生物标志物方面显示出巨大潜力。

精液代谢组学领域正在迅速发展，并在识别男性不育的精确生物标志物方面 holds significant promise。分析精子和精液的蛋白质和代谢组成 presents a minimally invasive approach to diagnosing infertility and distinguishing its underlying causes。然而，这些分析技术的临床实施仍然有限， largely due to the extensive variability in proteins, peptides, and metabolites within semen, which are influenced by both individual differences and environmental factors。

包括 established and emerging 的各种类型的生物标志物总结在 Table 1 中。

Section snippets

Diagnostic techniques for male infertility

准确的诊断工具对于识别根本原因和指导适当治疗至关重要。对生殖健康研究日益增长的兴趣带来了对不育及其诊断和预测的更好理解。在个性化医疗时代，关于生物标志物的信息必须被认真考虑，虽然传统的精液分析仍然是基石，但分子生物学、人工智能和组学技术的进步提供了有前景的新诊断途径。

Role of biomarkers in diagnosis and treatment selection

研究表明，男性中较高的SDF水平与自然受孕可能性降低和ART治疗失败概率较高相关。然而，当通过适当治疗降低SDF水平时，ART成功的机会显著提高。研究表明，调节ROS平衡和使用抗氧化剂可以改善ART结局。

研究强调了诸如HSP90和ACRBP等蛋白质作为与男性不育相关的生物标志物，具有预测ART结果的潜力。

Emerging therapeutic strategies

当精子质量存在问题或自然受孕无法发生时，使用ARTs。激素治疗，如使用促性腺激素或睾酮，用于与激素失衡相关的不育病例。外科治疗，包括精索静脉曲张切除术，用于纠正影响精子生产和功能的物理问题。生活方式改变，如饮食调整、体重管理和戒烟，也被认为可以改善精子参数。

Challenges and future directions

男性不育的治疗正在通过使用生物标志物而发展，因为它们有助于更精确地理解不育的根本原因，并允许设计个体化治疗。生物标志物可用于监测对应用疗法的反应，包括基因治疗、激素治疗和使用基于表观遗传学的方法。这些生物标志物在评估新疗法的效力和改善治疗个性化方面的作用至关重要。

Conclusion

生物标志物在男性不育中的识别和应用显著提高了诊断 precision 和个性化治疗策略。传统的SA虽然是基础性的，但缺乏 fully 评估男性生殖潜力的敏感性。基因组学、蛋白质组学、代谢组学和表观遗传学的新兴技术通过揭示影响精子质量和功能的分子和细胞机制，提供了对男性不育的更全面理解。生物标志物有潜力彻底改变男性不育的诊断和管理，为受影响的夫妇带来更有效的治疗选择和更好的结局。