揭示辛硫磷生物降解新机制：发现phoA基因簇的全球分布与生态解毒作用

　　本研究针对有机磷农药辛硫磷(phoxim, OP)的环境残留与毒性问题，通过分离Delftia lacustris PX-1菌株，首次解析了其新型代谢通路phoABC1C2DEFGHI基因簇的功能，证实PhoA、PhoB、PhoD酶介导的降解路径可有效将辛硫磷转化为低毒苯甲酸。研究发现phoA基因在全球耕地土壤中高度富集，且菌株可通过定植斑马鱼肠道缓解神经毒性，为微生物修复OP污染提供了理论依据。

　　

有机磷农药（Organophosphorus insecticides, OPs）作为农业生产中广泛使用的杀虫剂，在防治害虫的同时也带来严重的环境残留问题。其中，辛硫磷（phoxim）因其相对低毒的特性成为当前少数仍在广泛使用的OPs之一，但其代谢产物2-羟基亚氨基-2-苯乙腈（2H2P）的毒性及降解机制尚未明确。更值得关注的是，OPs通过不可逆抑制乙酰胆碱酯酶（acetylcholinesterase, AChE）活性引发神经毒性，对非靶标生物（如鱼类、昆虫等）造成威胁。因此，解析辛硫磷的完整降解路径、发掘高效降解菌株并评估其生态解毒潜力，成为环境微生物学领域的重要课题。

为系统探究辛硫磷的微生物降解机制，南京农业大学农业环境微生物学重点实验室的研究团队从稻田土壤中分离到一株高效降解菌Delftia lacustris PX-1，通过基因组学、转录组学、酶学表征及体内外毒性实验，揭示了其降解通路的关键基因与酶学基础，相关成果发表于《Environment International》。

本研究主要采用以下技术方法：通过传统富集培养法分离降解菌株，结合PacBio和Illumina平台完成全基因组测序；利用转录组分析（RNA-Seq）筛选诱导表达基因；通过异源表达纯化关键酶（PhoA、PhoB、PhoD）并测定酶动力学参数；以斑马鱼为模型进行急性毒性实验（LC₅₀测定）和脑组织AChE活性检测；利用荧光标记菌株（PX-1(gfp)）和qPCR技术分析肠道定植；基于全球土壤宏基因组数据（3,304个样本）分析phoA基因的分布规律。

3.1. Characteristics of phoxim-degrading strain PX-1

菌株PX-1被鉴定为Delftia lacustris，其基因组包含一条染色体和一条质粒。通过HPLC-MS分析，首次发现辛硫磷降解过程中产生6种代谢产物，包括O,O-二乙基硫代磷酸酯（M2）、2H2P（M3）、E-羟基亚氨基苯乙酸（HPA, M4）、苯甲腈（M5）和苯甲酸（M6），并提出一条新颖的代谢通路：辛硫磷→2H2P→HPA→苯甲腈→苯甲酸→TCA循环。菌株能以辛硫磷、2H2P或苯甲酸作为唯一碳源生长，且2H2P和苯甲酸的降解具有诱导性。

3.2. Prediction of phoxim-degrading genes in strain PX-1

转录组分析显示，质粒上的12个基因在2H2P诱导下显著上调。其中orf5762（phoB）和orf5754（phoD）编码硝基还原酶，orf5756（phoC1）和orf5757（phoC2）推测参与HPA脱羧，orf5743-5744（phoE-phoI）与苯甲酸降解基因簇（box）同源。

3.3. Functional identification of genes involved in phoxim degradation

3.3.1. PhoA converts phoxim to 2-hydroxyimino-2-phenylacetonitrile

PhoA（56.7 kDa）在30℃、pH 7条件下活性最高，其催化效率k_cat为0.20 min^?1。分子对接表明Ser423和His491是催化关键残基。

3.3.2. PhoB converts 2H2P to E-hydroxyimino-phenylacetic acid

PhoB（43.5 kDa）在50℃下活性最强，对2H2P的k_cat为1.77 min^?1，且不作用于苯甲腈。

3.3.3. PhoD converts benzonitrile to benzoate

PhoD（39.8 kDa）特异性水解苯甲腈，k_cat达218.10 s^?1，对2H2P无活性。

3.4. Global distribution and ecological significance of phoA gene

phoA同源基因分布于12个细菌门中，80.77%的携带物种为未培养微生物，主要集中于假单胞菌门（Pseudomonadota）的伯克霍尔德菌属（Burkholderia）和贪铜菌属（Cupriavidus）。其在耕地土壤中丰度最高，与人类活动密切相关。

3.5. Strain PX-1 detoxifies phoxim on zebrafish via degradation

3.5.1. Investigation of the toxicity of phoxim and its metabolites

辛硫磷和2H2P对斑马鱼的96-h LC₅₀分别为6.24 mg L^?1和3.66 mg L^?1（中等毒性），而HPA、苯甲腈和苯甲酸毒性较低（LC₅₀ > 10 mg L^?1）。

3.5.2. Phoxim-induced alterations of acetylcholinesterase activity

2 mg L^?1辛硫磷暴露96 h后，斑马鱼脑部AChE活性下降31.28%（P < 0.05），且呈剂量依赖性。

3.5.3. Detoxification of phoxim by strain PX-1

菌株PX-1处理后的辛硫磷污染水体毒性显著降低，且能定植斑马鱼肠道。暴露于6 mg L^?1辛硫磷的斑马鱼肠道中phoA基因拷贝数显著升高，表明辛硫磷促进菌株定植。

4. Discussion

本研究首次完整解析了辛硫磷通过pho基因簇（phoABC1C2DEFGHI）的降解路径，其中PhoA、PhoB、PhoD的功能得到实验验证。与既往菌株（如Cupriavidus nantongensis X1^T）相比，PX-1能完全矿化辛硫磷且不积累毒性中间体。phoA基因的全球分布模式提示其在耕地土壤修复中具应用潜力。水平基因转移（HGT）可能是OP水解酶基因广泛传播的重要原因，因phoA基因两侧存在Tn3家族转座子（Tn4430）和插入序列（ISAcde1、ISPps1）。此外，菌株通过肠道定植实现宿主-微生物互作解毒的机制，为农业环境污染的生物修复提供了新思路。

5. Conclusion

本研究揭示了Delftia lacustris PX-1介导的辛硫磷新型降解通路，明确了pho基因簇的功能及全球分布特征，证实了该菌株在斑马鱼模型中的解毒效应，为有机磷农药的微生物修复提供了理论依据和菌种资源。