ComEC结构域间分子互作调控自然转化中非转运链选择性降解的机制研究

　　本研究针对细菌自然转化中DNA摄取机制的核心问题，通过结构生物学与生化手段解析了ComEC蛋白的β-乳酰胺酶样结构域(BLACTMg)的核酸酶活性机制及其与OB折叠域的协同作用。研究发现BLACTMg依赖Mn2+发挥5'-3'外切/内切核酸酶活性，OB域通过静电作用增强DNA结合与局部浓度，进而促进链特异性降解。该工作揭示了ComEC介导DNA链分离、降解与转运的分子模型，为干预抗生素耐药性传播提供了新靶点。

　　

自然转化是细菌通过摄取环境DNA并整合至基因组实现水平基因转移的关键机制，直接推动抗生素耐药性在病原菌中的传播。这一过程依赖于复杂的分子机器，其中ComEC蛋白作为跨细胞质膜的DNA转运通道核心组件，长期因其结构复杂性和膜整合特性难以被深入研究。尽管已知ComEC包含跨膜通道域、OB折叠（oligonucleotide binding fold）和β-乳酰胺酶样结构域（β-lactamase-like domain），但其如何协同实现DNA链的分离、选择性降解及转运仍存在大量未知。

为解决这一难题，研究团队以Moorella glycerini的ComEC同源蛋白为模型，通过多学科方法揭示了其分子机制。研究首先解析了BLACT_Mg结构域的1.8?高分辨率晶体结构，发现其采用典型的αβ/βα折叠，属于金属β-内酰胺酶超家族（MBL），活性位点可结合磷酸根离子但需Mn²⁺协同激活。质谱分析证实BLACT_Mg在Mn²⁺存在时协调两个金属离子，突变关键金属配位残基（H598A、D602A等）或底物结合残基（S728A）均导致核酸酶活性丧失且体内转化完全抑制。

进一步酶活实验表明BLACT_Mg优先降解单链DNA（ssDNA），且对5′磷酸化末端具有更高活性。通过设计含硫代磷酸酯（PTO）键的底物，研究证实其同时具备内切酶和5′-3′外切酶活性，但不能从3′端切割。值得注意的是，单独BLACT_Mg的DNA结合能力极弱，而OB折叠域通过表面正电荷簇（如R112、R115、R122等）与DNA发生静电驱动的高亲和力结合（K_D=0.33 μM for dsDNA），且结合强度受离子浓度显著影响。

关键突破在于发现OB与BLACT结构域在同一多肽链上融合时（如OB-MBP-BLACT构建体），核酸酶活性提升7倍，表明OB域通过增加底物局部浓度增强催化效率。这种增强效应具有普适性，当BLACT与其它DNA结合域（如ComEA_Mg或Sac7d）融合时同样观察到活性提升，提示其机制主要依赖于物理邻近效应而非特异性定位。

基于结构预测和功能突变分析，研究提出了ComEC的工作模型：OB域首先捕获dsDNA，其后β-乳酰胺酶样结构域中保守环区（如Loop 2的F689/F691）作为“针环”（pin loop） destabilize DNA双链，引导5′链进入核酸酶活性中心降解，而3′链则通过芳香族残基（如W212、Y373等）衬砌的通道转运至胞内。体内转化实验证实，突变环2苯丙氨酸（F689A/F691A）或通道残基（W212A/Y373A）均显著降低转化效率，印证了这些区域在链分离与转运中的核心作用。

本研究综合运用X射线晶体学、核磁共振（NMR）、荧光各向异性、酶动力学及体内功能实验等技术。关键方法包括：①BLACT_Mg晶体结构解析（分辨率为1.8?）；②OB_Mg的NMR溶液结构测定；③时间梯度核酸酶活性检测（使用FAM标记的ssDNA/dsDNA底物）；④荧光各向异性结合实验（测定DNA-蛋白互作K_D）；⑤Legionella pneumophila Lp02菌株的天然转化效率分析。样本为重组表达的M. glycerini蛋白及L. pneumophila突变菌株。

The β-lactamase-like domain of ComEC degrades DNA through a two-metal-ion catalytic mechanism

研究通过晶体结构揭示BLACT_Mg采用MBL家族典型折叠，依赖双Mn²⁺离子催化机制。突变实验表明金属配位残基（H598、D600、D602等）的替换使酶活完全丧失，体内转化受阻。

BLACT_Mg is an endonuclease and 5′-to-3′ exonuclease in vitro

酶活实验证明BLACT_Mg具有双重切割模式，优先降解ssDNA且偏好5′磷酸化末端，PTO底物实验明确其外切方向性为5′-3′。

The OB fold of ComEC binds to DNA with high affinity through an electrostatically driven interaction

NMR解析的OB结构显示其通过表面正电荷簇结合DNA，荧光各向异性实验证实其与dsDNA结合更强（K_D=0.33 μM），且结合能力随离子强度升高而降低。

The OB fold and β-lactamase-like domain work in concert for efficient nuclease activity

域间融合实验表明OB与BLACT的物理连接显著提升降解速率，且该效应可被其他DNA结合域替代，证实局部浓度增加是主要机制。

Key residues in ComEC guide ssDNA towards the nuclease active site and into the competence channel

结构预测识别出保守环（Loop 1和Loop 2）作为潜在解链引导元件，其中F689/F691双突变完全抑制体内转化，通道残基突变（W212A/Y373A）亦显著降低效率，提示其共同介导链分离与转运。

本研究首次整合ComEC多域的结构与功能数据，提出其通过OB域捕获DNA、β-乳酰胺酶样结构域执行链特异性降解、跨膜通道转运的协同机制。该模型解释了自然转化中DNA单向转运的分子基础，为针对细菌进化及耐药性传播的干预策略提供了新视角。论文发表于《Nucleic Acids Research》，为理解水平基因转移的生化机制树立了重要里程碑。