基于自上而下质谱技术的重组蛋白及其片段化表征新策略研究

　　本研究针对重组蛋白结构完整性与片段化分析难题，建立了基于HCD、EThcD和UVPD多模式碎裂技术的自上而下质谱方法。通过对胶原蛋白（RC1/RC2）和干扰素α2b的系统研究，实现了高达93.7%的残基断裂覆盖率，突破了传统自下而上方法对重复序列蛋白的分析局限，为生物药物质控提供了新范式。

　　

在生物医药领域，重组蛋白药物已成为疾病治疗的重要武器，其市场规模以每年7-18%的速度持续增长。然而，这些大分子药物相比小分子药物具有更复杂的结构特征，给质量控制带来巨大挑战。特别是像胶原蛋白这类具有高度重复序列的蛋白质，传统的质谱分析方法往往力不从心——就像试图用拼图方式还原一幅抽象画，由于图案重复度过高，很难确定每个片段的确切位置。

目前主流的分析方法主要存在两大痛点：其一是基于色谱分离与酶解肽段映射的方法(CFEP)，虽然特异性高但流程繁琐，且无法区分重复序列的来源；其二是直接质谱分析结合特征肽段验证的方法(DMSP)，虽然速度较快但对质量测量精度要求极高，且容易受到样品处理过程中人为降解的干扰。这些局限性促使科学家们寻找更直接、更准确的分析方案。

在这项发表于《The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics》的研究中，Long Zhen等人开发了一套创新的自上而下质谱平台，能够直接对完整蛋白质进行分析，避免了酶解步骤带来的信息丢失。研究人员选用了三种具有代表性的重组蛋白作为模型：重组胶原蛋白1型(RC1, 15.037 kDa，无二硫键)、重组胶原蛋白2型(RC2, 49.859 kDa，无二硫键)和干扰素α2b(19.497 kDa，含两个二硫键)，涵盖了不同的分子量范围和结构特征。

研究采用的主要技术方法包括：基于ThermoFisher Scientific? Orbitrap Eclipse? Tribrid?质谱平台的多模式碎裂技术（HCD、EThcD和UVPD）；针对不同分子量蛋白质优化的靶向MS2和数据依赖性采集(DDA)工作流程；二硫键还原预处理技术；以及使用Biopharma Finder?软件进行数据处理和数据库搜索。所有样品均由国家食品药品检定研究院提供，确保了样品的标准性和可靠性。

3.1. 重组胶原蛋白

3.1.1. 序列覆盖率分析

研究人员首先通过高分辨率质谱准确测定了RC1的完整分子量，选择m/z 836 (18+)和1504 (10+)两个丰度最高的前体离子进行靶向分析。结果发现较低电荷状态(10+)的序列覆盖率(57%)显著高于高电荷状态(18+)的36%，这是因为低电荷状态产生的碎片离子更少发生内部断裂，分辨率更高。结合两种电荷状态的数据，覆盖率可提升至69%。

除了常规的HCD碎裂，研究还评估了EThcD和UVPD技术的表现。研究发现蛋白质分析中的ETD反应时间需要优化——较大的变性蛋白质（约15 kDa）带有更多电荷，需要较短的反应时间（10 ms）以避免过度碎裂。UVPD技术由于能产生a/x、b/y、c/z等多种碎片离子类型，实现了最高的序列覆盖率（84%）。将多种解离方法结合使用，使RC1的残基断裂覆盖率达到了惊人的93.57%。

对于大分子量蛋白RC2 (49.858 kDa)，研究人员发现UVPD仍然表现最佳，这归因于其高能活化机制能有效断裂蛋白质骨架。虽然HCD和UVPD都产生了可观的覆盖率，但整合HCD、UVPD和EThcD的数据后，RC2的总残基断裂覆盖率达到了49.8%。值得注意的是，随着分子量增加，不同技术产生的碎片离子重叠度显著降低——RC2中仅有2.5%的断裂位点被所有三种技术同时检测到，而RC1中这一比例高达52.4%，表明对大蛋白的分析越来越需要多技术整合。

3.1.2. 分析RC1片段的多方法比较

为了鉴定RC1中发现的片段（如峰3，单同位素质量：10,406.0732 Da），研究人员比较了四种方法的性能：高分辨率完整质量测量、肽段映射、靶向自上而下MS2和DDA自上而下MS2。

单纯依靠分子量无法区分序列2-118和1-117这两个可能来源，因为它们的总质量差异相互抵消。肽段映射方法虽然检测到了非特异性肽段，但由于序列重复性，无法明确归属到特定区域。靶向自上而下MS2方法结合HCD、UVPD和EThcD，对10.4 kDa片段实现了97.41%的残基断裂覆盖率，所有产物离子都确证该片段为1-117而非2-118。单种方法的覆盖率也很高（HCD:78%，EThcD:85%，UVPD:84%），表明对于30 kDa以下的蛋白质，使用任何一种碎裂方法结合靶向MS2都能获得满意的结果。

DDA自上而下方法使用HCD碎裂，尽管片段分子量较大(10.4 kDa)，仍产生了丰富的产物离子，识别了50%的键断裂，所有诊断离子都确证片段序列为1-117。Orbitrap分析仪的超高分辨率使前体离子(-0.29 ppm)和产物离子都表现出 exceptional 的质量精度。

3.1.3. RC1中的片段

通过DDA自上而下方法，研究人员在RC1中鉴定出23个肽键断裂产生了27个片段。大部分骨架断裂发生在Gly(G)或Asp(D)残基处——这与单克隆抗体等其他重组蛋白中报告的断裂模式一致。

23个断裂位点中有5个是Gly-Xaa或Xaa-Gly（Xaa为Ala、Leu或Val）。当Xaa为Val、Leu或Ala时，Gly-Xaa或Xaa-Gly位点的水解是一种已知的断裂机制。在酸性或碱性条件下，肽键水解通过四面体中间体进行，随后发生键断裂，这一机制不涉及断裂位点侧链的参与。

6个断裂位点发生在Asp-Xaa或Xaa-Gly模体（Xaa为Gly、Lys、Asn和Ala）。其中C端Asp残基断裂是单克隆抗体中记载的降解途径，水解可能是其机制。

7个断裂位点涉及Gly-Xaa或Xaa-Gly模体（Xaa为Arg或Lys）。丰度最高的三个峰（峰#11、#12和#21）都源自Arg-Gly序列。由于Arg和Lys都是胰蛋白酶的经典断裂位点，研究人员推测重组胶原蛋白的断裂可能不仅来自肽键水解，还可能来自胰蛋白酶的潜在污染。实验验证支持了这一推测：向胶原样品中添加少量胰蛋白酶后，这些特定片段的丰度进一步增加。

基于这些发现，研究人员提出了提高重组胶原产品稳定性的策略：通过序列优化避免连续Gly-Xaa/Xaa-Gly重复；将不稳定的Gly-Pro-Gly序列替换为Gly-Pro-Hyp（羟化脯氨酸）；将储存缓冲液pH控制在近中性(pH 6.0-8.0)以抑制酸/碱催化水解；通过提高重组胶原纯度最大限度减少酶污染。

3.2. 干扰素α2b

干扰素α2b是一个原核表达的蛋白质(19.269 kDa)，含有两个二硫键。在表达后加工过程中，它经过酶切去除N端甲硫氨酸(M)，产生成熟治疗产品。因此需要严格的质谱序列分析来确认全长前体(保留M)和成熟片段(缺失M)。

二硫键赋予的结构刚性抑制了自上而下蛋白质组学中的骨架断裂。为了克服这一限制，分析前必须进行二硫键还原（使用TCEP或DTT）。这一还原步骤切割S-S键，线性化蛋白质，从而实现更高效的骨架断裂以进行序列验证。

与重组胶原不同，干扰素α2b的较高电荷状态比较低电荷状态产生了更高的残基断裂覆盖率。因此选择m/z 1764.63进行全长前体的靶向分析。虽然EThcD能有效断裂干扰素α2b的N端和C端区域，但在内部区域（如残基61-100）表现较差。相比之下，UVPD和HCD在这些区域都提供了 robust 的断裂。整合所有三种活化方法的数据，累计残基断裂覆盖率达到96.7%。

研究检测到了干扰素α2b的全长前体和成熟加工形式。成熟形式的断裂覆盖趋势与全长前体相同：UVPD实现了最高序列覆盖率(85%)，其次是HCD(74%)和EThcD(64%)。整合所有三种活化方法，成熟蛋白质的残基断裂覆盖率达到94.51%。

通过比较自上而下分析中相应质量面积，全长形式占总干扰素α2b信号的34.39%。自下而上分析通过鉴定N端肽段CDLPQTHSLGSR（成熟）和MCDLPQTHSLGSR（全长前体）确认了两种形式的存在。总体而言，自上而下和自下而上结果在序列鉴定方面基本一致，尽管观察到一些定量差异：全长干扰素α2b的比例在自下而上结果(40.85%)中略高于自上而下数据(34.39%)。

本研究建立了一个强大的自上而下质谱平台，用于表征重组蛋白序列和断裂谱，为生物药物开发中的质量评估提供了可行策略。研究表明，通过整合多种碎裂技术(EThcD、HCD和UVPD)，可以 consistently 实现高残基断裂覆盖率——对RC1和干扰素α2b等20 kDa以下的蛋白质超过93%。即使对RC2等较大蛋白质(49.8 kDa)，也达到了49.5%的显著覆盖率，证明了该方法在宽分子量范围内的适用性。

研究提出了针对重组蛋白常规鉴定的实用策略：对12 kDa以下的蛋白质，采用基于DDA的自上而下方法结合HCD提供高通量解决方案；对全面的结构评估，推荐采用整合多解离技术的靶向MS2；UVPD是自上而下分析的首选解离方法，特别是对高分子量蛋白质；为提高残基断裂覆盖率，MS分析前需要进行二硫键还原预处理。

对胶原蛋白的鉴定，传统的自下而上蛋白质组学方法因高度重复序列的存在而受限。相比之下，自上而下方法能够进行完整蛋白质形式分析，规避了与序列冗余相关的映射模糊性。使用该方法，在重组胶原中鉴定出了多个骨架断裂位点。近一半的断裂位点是Asn-Xaa、Xaa-Asn、Gly-Xaa或Xaa-Gly，水解被报道为其潜在机制。为减少此类片段，必须严格控制储存这些蛋白质所用缓冲液的pH。此外，残基修饰也能增强蛋白质稳定性。除了上述断裂位点，还被鉴定出Gly-Xaa或Xaa-Gly位点（Xaa为Arg或Lys）。值得注意的是，三个峰面积最大的片段都来自Gly-Arg键的断裂。这些发现表明，除水解外，其他因素也可能导致胶原断裂。例如，未纯化的蛋白质样品污染了其他蛋白酶（如胰蛋白酶）可能导致蛋白质降解。因此，在生产和储存过程中确保高蛋白质纯度对于维持胶原完整性至关重要。

这项研究不仅展示了首个为重组蛋白断裂分析量身定制的自上而下平台，还为难以分析的生物制剂设立了新的表征深度标准——提供了自下而上或混合方法无法实现的见解。该技术平台的成功建立，将对生物制药行业的质量控制产生深远影响，特别是在创新生物药开发和仿制生物药一致性评价中发挥关键作用。