层层自组装透明质酸/壳聚糖包覆Fe3O4@rGO纳米粒用于乳腺癌细胞阿霉素递送系统的构建与表征

　　本研究针对磁性纳米粒子( MNPs)在生理环境中易氧化和磁化强度降低的问题，通过溶剂热法合成Fe3O4@rGO(FR)纳米粒子，并采用层层自组装(LbL)技术构建透明质酸(HA)/壳聚糖(CHI)多层膜包覆的多功能纳米载药系统(FR-HC@DOX)。该系统展现出26.04 emu/g的高饱和磁化强度、显著的pH响应释药特性(pH 5.5条件下释放率达100%)及对MCF-7乳腺癌细胞的强效杀伤作用，为靶向磁导化疗提供了创新解决方案。

　　

在纳米医学迅猛发展的今天，磁性纳米粒子(Magnetic Nanoparticles, MNPs)因其独特的超顺磁性和对外加磁场的快速响应能力，在靶向药物递送、磁热疗和医学成像等领域展现出巨大潜力。其中，四氧化三铁(Fe₃O₄)纳米粒子尤为引人注目。然而，它们也面临着一个棘手的难题：在生理环境中容易发生氧化，导致磁化强度显著降低，从而削弱其磁导向功能。此外，传统的聚合物涂层虽然能改善生物相容性，但往往以牺牲磁性能为代价，使得许多报道的聚合物包覆Fe₃O₄系统的饱和磁化强度(M_s)降至20 emu/g以下。另一方面，如何实现药物的可控释放，特别是在肿瘤微酸性环境(pH ~5.5)下的特异性释放，同时避免在正常生理环境(pH 7.4)下的提前泄漏，是提高化疗效果并降低毒副作用的关键。

为了突破这些瓶颈，来自伊斯坦布尔理工大学的研究团队开展了一项创新性研究，他们巧妙地将还原氧化石墨烯(rGO)的稳定特性、磁性纳米粒子的导向功能、以及天然多糖的生物特性相结合，构建了一种新型的多功能纳米载药平台。相关研究成果发表在《Journal of Science and Medicine in Sport》上。

本研究主要采用了几个关键的技术方法：1）通过溶剂热法合成Fe₃O₄@rGO (FR)纳米粒子，并优化反应时间（10, 15, 20小时）及500°C下煅烧1小时以增强结晶度；2）利用层层自组装(Layer-by-Layer, LbL)技术，基于静电相互作用，交替沉积带负电的透明质酸(Hyaluronic Acid, HA)层（内嵌模型药物阿霉素Doxorubicin, DOX）和带正电的壳聚糖(Chitosan, CHI)层，构建核壳结构的FR-HC@DOX纳米载药系统；3）使用MCF-7人乳腺癌细胞系和MCF-12A非肿瘤性乳腺上皮细胞系进行体外细胞毒性(MTT法)、细胞凋亡(Annexin V染色流式细胞术)和细胞摄取(免疫荧光显微镜)实验，以评估其生物效应。

3.1. XRD, DLS, Raman, XPS, and FT-IR characterization of the samples

通过X射线衍射(XRD)分析证实，经过20小时溶剂热反应并经500°C煅烧后的FR纳米粒子，其衍射峰与立方尖晶石结构的Fe₃O₄标准卡片(JCPDS No. 19-0629)完美匹配，表明结晶度良好。动态光散射(DLS)显示其平均流体动力学粒径约为164纳米。拉曼光谱(Raman)揭示了Fe₃O₄的特征峰（~208, 273, 388 cm^-1）以及rGO的D峰和G峰，I_D/I_G比值的变化证明了GO的成功还原以及LbL涂层和DOX加载对碳结构缺陷的影响。X射线光电子能谱(XPS)和傅里叶变换红外光谱(FT-IR)分析则清晰地展示了在LbL涂层后，氮(N)元素的出现以及C–O、C=O等官能团信号增强，从化学键层面证实了HA、CHI和DOX的成功引入和均匀包覆。

3.2. VSM measurements and Zeta potential of the samples

振动样品磁强计(VSM)测量是研究的亮点之一。结果表明，随着合成时间从10小时延长至20小时，FR纳米粒子的饱和磁化强度(M_s)从35.08 emu/g显著提升至43.87 emu/g，这归因于更完善的结晶和磁畴生长。经过LbL包覆(FR-HC)和载药(FR-HC@DOX)后，M_s有所下降，但FR-HC@DOX仍保持了26.04 emu/g的足够高的磁化强度，远高于大多数文献报道的聚合物包覆体系，确保了其在外磁场下的有效操控能力。zeta电位测量显示，原始FR纳米粒子表面带负电（-21.5 mV），经过HA/CHI多层包覆后，电位趋于中性（-9.9 mV），这种变化有助于提高纳米粒子的胶体稳定性和生物相容性，减少非特异性蛋白质吸附，延长体内循环时间。

3.3. TEM analyses of the samples

透射电子显微镜(TEM)图像直观地展示了纳米粒子的形貌和结构演化。未包覆的FR样品中，球形Fe₃O₄纳米粒子（平均直径约25 nm）均匀分布在rGO片层上。而在FR-HC@DOX样品中，可以清晰地观察到核壳结构，磁性核心被一层厚度约4 nm（经过三个LbL循环后）的聚合物壳层所包裹。元素映射(EDS)进一步证实了Fe、O、C元素的均匀分布，以及N元素在壳层中的成功引入，这与CHI和DOX的含胺基团相对应，从空间分布上证明了涂层的成功构建。

3.4. Fluorometric analysis of samples

利用DOX自身的内源性荧光特性，研究人员通过荧光光谱分析直接证明了药物的成功加载。FR和FR-HC纳米粒子在520-700 nm波长范围内没有检测到荧光信号，而FR-HC@DOX则在600 nm附近显示出强烈的DOX特征荧光发射峰，为药物高效负载提供了最直接的证据。

3.5. Evaluation of drug content and in vitro release kinetics of FR-HC@DOX samples

药物负载量(DLC)评估显示，随着LbL涂层层数的增加，DOX的负载量和负载效率均逐步提高，三层涂层的DLC达到4.6%。体外释药实验是检验其“智能”响应的关键。结果非常令人振奋：在模拟肿瘤微环境的酸性条件(pH 5.5)下，56小时内DOX的累积释放率接近100%；而在模拟正常组织的生理条件(pH 7.4)下，同期释放率仅为13%，表现出极强的pH敏感性。释药动力学拟合表明，在pH 5.5下的释放遵循Fickian扩散机制（Korsmeyer-Peppas模型，n = 0.3537），这表明药物是通过扩散从水合的聚合物基质中释放出来的，是一个可控的过程。

3.6. Assessment of nanoparticle-induced cytotoxicity and cellular internalization

最终的细胞实验验证了该纳米平台的生物学效果。MTT细胞毒性试验表明，空的FR和FR-HC纳米粒子在高达80 μg/mL的浓度下，对MCF-7癌细胞和MCF-12A正常细胞都表现出良好的生物相容性。而载有DOX的FR-HC@DOX则对MCF-7癌细胞表现出剂量和时间依赖性的强效杀伤作用，处理24小时后，在80 μg/mL浓度下细胞存活率显著降低。流式细胞术凋亡检测(Annexin V染色)进一步揭示，FR-HC@DOX处理能诱导癌细胞发生显著凋亡。免疫荧光显微镜观察直观地显示，FR-HC@DOX能被MCF-7细胞有效内化，DOX的红色荧光信号遍布于细胞质和细胞核中，证明了成功的细胞摄取和药物递送。值得注意的是，基于HA的CD44受体介导的内吞作用可能是其细胞摄取的主要途径。

综上所述，本研究成功地设计并构建了一种集多种功能于一体的新型纳米载药系统FR-HC@DOX。该研究通过巧妙的材料设计和精细的制备工艺，实现了几个重要突破：1）利用rGO包覆有效解决了Fe₃O₄纳米粒子的氧化不稳定问题，并在多层聚合物包覆后仍保持了卓越的磁性能(M_s = 26.04 emu/g)，为磁靶向输送奠定了坚实基础；2）LbL自组装技术实现了对涂层厚度和组成的精确控制，并允许将药物（DOX）直接嵌入到功能层（HA）中，提高了负载效率；3）该系统展现了前所未有的pH响应释药特性，能够在肿瘤微环境下近乎完全释放药物，而在正常生理环境下几乎不泄漏，极大地提高了治疗的靶向性并有望降低全身毒性；4）体外生物学评价证实了其良好的生物相容性和对癌细胞的特异性杀伤作用。

这项研究不仅为克服磁性纳米药物在临床转化中面临的关键挑战提供了有效的解决方案，而且其模块化的LbL设计思路为开发其他类型的靶向、刺激响应型纳米药物提供了新的范式。它将结构稳定性、磁导航、主动靶向（通过HA-CD44相互作用）和可控释药等多种功能集成于一个单一的纳米平台，标志着向更高效、更安全的癌症纳米医学迈出了重要一步。未来的研究将聚焦于其长期稳定性、体内药代动力学和抑瘤效果评估，以推动其向临床应用转化。