滑膜肉瘤中SS18::SSX新型相互作用蛋白CBX4的发现及其临床意义

　　本研究针对滑膜肉瘤关键驱动因子SS18::SSX相互作用组不明确的难题，利用特异性抗体通过免疫沉淀质谱技术，在6个人源细胞系中首次鉴定出CBX4作为其新型相互作用蛋白。组织芯片分析证实CBX4在滑膜肉瘤中特异性高表达，揭示了其与PRC1复合物的潜在关联，为靶向表观遗传治疗提供了新方向。

　　

在青少年和年轻成人群体中，滑膜肉瘤是一种具有高度侵袭性的恶性肿瘤，其最典型的特征是易复发和转移。这种肿瘤的幕后推手，是一个由染色体易位t(X;18)产生的特殊融合蛋白——SS18::SSX。它就像一把钥匙，通过扰乱细胞内的表观遗传状态，开启了肿瘤的发生和发展之门。然而，尽管科学家们知道SS18::SSX非常重要，但由于一直缺乏能够精准捕捉天然状态下该蛋白的抗体，研究其相互作用伙伴（即相互作用组）的工作进展缓慢，大多数研究只能依赖外源标签在少数细胞系中进行，这极大地限制了对滑膜肉瘤生物学机制的深入理解。

为了解决这一瓶颈问题，一项发表于《Laboratory Investigation》的研究取得了突破。研究人员利用一款能特异性识别SS18::SSX融合位点（见于95%的病例）的新型单克隆抗体，首次在无需外源标签的情况下，直接对六种人源滑膜肉瘤细胞系中内源性的SS18::SSX蛋白进行了免疫沉淀-质谱（IP-MS）分析。这项研究不仅揭示了该癌蛋白存在此前未被证实的可变剪接异构体，更重要的是，发现并验证了多梳抑制复合物（PRC1）的关键成员——染色盒蛋白4（CBX4）是SS18::SSX的一个 novel interactor（新型相互作用蛋白）。

关键技术方法概述

研究采用了六种经鉴定的永生化人滑膜肉瘤细胞系（如HSSYII、SYO1等）和U2OS骨肉瘤细胞系（阴性对照）。核心技术包括：使用特异性抗SS18::SSX抗体进行免疫共沉淀（Co-IP）；通过液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）进行蛋白质组学分析；利用Western Blot和免疫荧光（IF）进行蛋白相互作用验证；最后，在一个包含337个样本（涵盖12种肉瘤亚型、癌组织和正常组织）的大型组织微阵列（TMA）上进行CBX4等的免疫组织化学（IHC）染色及量化评分（H-score），以分析其表达谱。

研究结果

免疫沉淀内源性SS18::SSX癌蛋白并通过基于质谱的蛋白质组学分析鉴定出选择性异构体

通过Western Blot分析，研究人员在滑膜肉瘤细胞中观察到了两条分别约为65 kD和75 kD的SS18::SSX条带。质谱分析揭示，这两条带源于SS18基因第8号外显子（exon 8）的可变剪接。在65 kD的异构体中，源自第8号外显子的肽段丰度显著降低，这表明该异构体可能缺失或部分缺失了此区域，从而在分子量上更小。这是首次在蛋白质水平证实了SS18::SSX存在不同的剪接变体。

CBX4是SS18::SSX相互作用组中的顶级候选者

对六个滑膜肉瘤细胞系的IP-MS数据进行深入分析后，研究人员设定了严格的筛选标准（在至少两个细胞系中，IP:SS18::SSX相较于IP:IgG的富集倍数log2FC > 1，且在阴性对照U2OS细胞中无富集），最终从2377个鉴定到的蛋白中筛选出9个高置信度的候选相互作用蛋白。其中，CBX4在四个细胞系中均被显著富集，出现频率最高，成为顶级候选者。进一步的Co-IP和Western Blot在所有六个滑膜肉瘤细胞系中均成功验证了CBX4与SS18::SSX的相互作用。免疫荧光显示，在SYO1细胞中，CBX4与SS18::SSX类似，呈现点状的核内聚集。

在原代人滑膜肉瘤肿瘤中验证CBX4蛋白表达

研究人员首先在一个专门的滑膜肉瘤组织芯片（TMA）上对CBX4及其他多个表观遗传相关标志物（SS18::SSX、SSX、BRG1、H2AK119Ub、USP7）进行了染色和量化。结果显示，CBX4的核表达模式与SS18::SSX和SSX高度相似，在滑膜肉瘤样本中的表达水平显著高于其他肿瘤类型和正常组织对照。而其他已知的相互作用蛋白（如BRG1、H2AK119Ub、USP7）则未显示出这种特异性。此外，CBX4的表达水平在滑膜肉瘤的不同组织学亚型（单相性、双相性、低分化）之间没有显著差异。

分析CBX4蛋白在肉瘤和正常组织中的表达

为了更全面地了解CBX4的表达模式，研究团队将分析扩展至10个不同的TMA，共包含337个样本，涵盖了广泛的肉瘤亚型、癌组织及正常组织。大规模分析证实，滑膜肉瘤中的CBX4蛋白表达水平显著高于大多数其他肉瘤（如腺泡状横纹肌肉瘤、恶性外周神经鞘瘤、脂肪肉瘤等）、癌组织以及正常组织。值得注意的是，尤文肉瘤和粘液样脂肪肉瘤（同为好发于年轻人的融合基因驱动型肉瘤）也表现出相对较高的CBX4表达，但其水平仍低于滑膜肉瘤。对正常睾丸组织（SSX的正常表达部位）的分析显示，CBX4在生精小管中的表达模式与SSX和H2AK119Ub部分重叠但又不完全相同，提示其相互作用的复杂性。

研究结论与意义

本研究成功地利用内源性特异性抗体，首次在多个人源滑膜肉瘤细胞系中系统性地绘制了SS18::SSX的相互作用组，并鉴定出CBX4作为一个全新的、高置信度的相互作用蛋白。这是首次将SS18::SSX与经典多梳抑制复合物（cPRC1）的特异性组分联系起来。CBX4作为cPRC1的成员，不仅能识别PRC2 deposited的H3K27me3标记，还具备相分离能力和SUMO E3连接酶活性，这些特性都与SS18::SSX已知的生物学功能（如形成核内凝聚体、导致广泛基因沉默）高度相关。

其重要意义在于：

1. 1.

   揭示了新的致病机制：SS18::SSX与CBX4的相互作用提示，除了之前已知的非经典PRC1.1（ncPRC1.1），癌蛋白可能也通过干扰经典PRC1（cPRC1）的功能来驱动滑膜肉瘤的表观遗传失调，这为理解其致病机制提供了全新视角。

2. 2.

   提供了潜在的诊断生物标志物：CBX4在滑膜肉瘤中特异性高表达，使其成为一种有潜力的诊断辅助标志物，有助于与其他软组织肉瘤进行鉴别诊断。

3. 3.

   指明了新的治疗方向：CBX4被证明是滑膜肉瘤细胞的生存依赖（dependency），这意味着靶向CBX4或其相关通路（如SUMO化）可能成为治疗滑膜肉瘤的新策略。本研究为开发针对CBX4或PRC1复合物的靶向疗法奠定了坚实的理论基础。

总之，这项研究不仅攻克了长期存在的技术难题，更重要的是为理解滑膜肉瘤的生物学特性开辟了新道路，发现了新的潜在治疗靶点，对未来改善患者预后具有重要的转化医学价值。