基于UPLC-MS/MS分析、生物活性筛选与机器学习的生/盐制韭子软骨保护剂整体发现及质控研究

　　本研究创新性地整合UPLC-MS/MS定量分析、体外生物活性筛选、灰色关联分析(GRA)与机器学习(ML)技术，首次系统鉴定出生/盐制韭子(SAT)中关键软骨保护活性成分（橙皮素、槲皮素等）。研究构建了精准定量方法（LOQs低至0.05 ng/mL，回收率97.65–103.44%），并通过决策树模型（R2p>0.91）实现活性预测，为中药标准化与精准医疗提供新范式。

　　

Highlight

通过超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)分析、基于细胞的生物测定和灰色关联分析(GRA)相结合的整合生物关联方法，成功区分了生品和盐制韭子(SAT)。据我们所知，本研究首次报道使用UPLC-MS/MS同时定量生品和盐制SAT中的十种生物活性化合物。其中，橙皮素、槲皮素和表儿茶素被确定为软骨保护活性的关键贡献者，并通过单体化合物测试得到验证。在评估的十一种机器学习模型中，决策树回归实现了最佳性能（校准集R²_c: 0.9961，验证集R²_p: 0.9124；校准集均方根误差RMSEC: 0.0058，验证集均方根误差RMSEP: 0.0316）。这项工作不仅精确定位了关键的软骨保护标志物，而且为SAT的质量控制和生物活性预测提供了一个强大的化学计量学驱动框架。这些发现为SAT在软骨保护疗法中的标准化制备和临床应用铺平了道路，符合现代分析和精准医疗对草药的要求。

Chemicals and materials

化学试剂与材料

标准品，包括表儿茶素、杜荆素、金丝桃苷、橙皮内酯水合物、柚皮苷、木犀草素、槲皮素、柚皮素、山奈酚和橙皮素，均购自四川维克奇生物科技有限公司，各化合物纯度均超过98%。其结构显示在补充材料图S1中。高效液相色谱(HPLC)级乙腈购自默克公司(Merck Co.)，所有溶液均使用Milli-Q超纯水系统制备的超纯水配制。盐由江苏省盐业集团有限责任公司提供。

Optimization of extraction conditions

提取条件的优化

系统优化了三个关键提取参数，包括料液比(1:10–1:50)、甲醇浓度(10–90%, v/v)和提取时间(20–60 min)，以最大化超声提取效率。如图2A所示，将料液比从1:10增加到1:40提高了十种主要化合物的提取率，但超过1:40后没有进一步改善，表明此比例为最佳。同样，将甲醇浓度从10%提高到70%也观察到提取率的增加，但浓度超过70%后，提取率趋于平稳或略有下降，因此选择70%甲醇作为最佳浓度。提取时间在20到40分钟内对提取效率有积极影响，但更长的提取时间（超过40分钟）并未带来显著增益，反而可能导致热降解，故选择40分钟作为最佳提取时间。最终确定的最佳提取条件为：料液比1:40 (g/mL)，70%甲醇(v/v)，超声提取40分钟。在此优化条件下，十种分析物的提取效率高且重现性好。

Conclusions

结论

一项整合了超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)、基于细胞的生物测定和灰色关联分析(GRA)的生物关联方法，成功区分了生品和盐制韭子(SAT)。据我们所知，本研究首次报道了使用UPLC-MS/MS同时定量生品和盐制SAT中的十种生物活性化合物。其中，橙皮素、槲皮素和表儿茶素被确定为关键的质量标志物，对SAT的软骨保护活性贡献最大。此外，机器学习模型，特别是决策树回归，在预测软骨保护功效方面表现出色。这项研究不仅为SAT的质量控制提供了科学依据，而且展示了将先进分析技术与化学计量学相结合以阐明复杂草药基质生物活性的强大能力，这一策略可广泛应用于其他传统药物研究。