杜氏肌营养不良症基因中意外拷贝数变异（CNV）的临床意义与诊断策略研究

　　本文报道了荷兰莱顿大学医学中心团队针对32例在微阵列分析中意外发现的DMD基因大片段缺失/重复的研究。通过MLPA验证、FISH定位和家系 segregation 分析，研究人员发现56%的病例最终确诊为肌营养不良症（18例），强调了对DMD基因意外CNV发现必须进行遗传学验证和临床随访的重要性。该研究为新生儿DMD筛查和CNV解读提供了重要指导，发表于《Neuromuscular Disorders》。

　　

随着比较基因组杂交芯片（aCGH）和单核苷酸多态性（SNP）芯片技术在遗传诊断中的广泛应用，临床上越来越多地在杜氏肌营养不良症（Duchenne Muscular Dystrophy, DMD）基因中发现意料之外的拷贝数变异（Copy Number Variants, CNVs）。这些变异通常是在因发育迟缓、先天性异常或其他无关适应症进行检测时偶然发现的，其临床意义常不明确。DMD基因位于X染色体短臂（Xp21.2p21.1），是人类最大的基因，跨度约2.2 Mb，包含79个外显子，编码427 kDa的肌营养不良蛋白（dystrophin）。该基因的致病性变异可导致杜氏肌营养不良（DMD）和贝氏肌营养不良（Becker Muscular Dystrophy, BMD），统称为肌营养不良症（dystrophinopathies）。

尽管90%的病例遵循“阅读框规则”（reading frame rule）——即移码（out-of-frame, OOF）变异通常导致严重的DMD，而框内（in-frame, IF）变异导致较轻的BMD，但仍有10%的例外情况。此外，女性携带者虽多无症状，但也有发生心肌病和肌肉症状的风险。如何准确解读这些意外发现的CNV，成为临床遗传学面临的重要挑战。为此，荷兰莱顿大学医学中心临床遗传学系的Ieke B. Ginjaar、Hermine A. van Duyvenvoorde等研究者开展了一项回顾性研究，成果发表在《Neuromuscular Disorders》上。

研究人员主要采用了多重连接依赖性探针扩增（Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification, MLPA）对微阵列结果进行验证和细化；使用荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization, FISH）技术确定重复变异的位置（是否位于DMD基因内或插入其他基因组区域）；并开展家系 segregation 分析，在成年无症状男性亲属中验证变异的致病性。此外，研究还依托莱顿开放变异数据库（LOVD-DMD）进行基因型-表型关联分析。样本来源于荷兰多家临床遗传学中心转诊的51例患者，最终纳入32例（19例缺失，13例重复），包括 postnatal 临床病例和产前诊断案例。

3. Results

3.1. DMD deletions

通过MLPA分析，19例缺失病例中12例与芯片结果完全一致，5例在外显子范围上存在差异。共发现16种不同的缺失，其中3种在多个家系中重复出现（外显子2-9、外显子45、外显子50-51）。经基因型-表型分析和家系验证，10例男性确诊为肌营养不良症（5例DMD、2例BMD、3例未分类型），6例女性为携带者。值得注意的是，外显子2-9缺失虽然在两例胎儿中发现且预测为移码突变，但因存在于无症状成年男性亲属中，被归类为“可能良性”。而外显子56-60框内缺失虽在一位5岁患儿和无症状祖父中同时存在，但因数据库中有该缺失致病的报道，最终归类为“意义未明”（VUS）。

3.2. DMD duplications

13例重复病例中，11例经MLPA确认。FISH分析显示，8例重复位于Xp21区，1例（病例27）插入Xq25-26而排除致病性。绝大多数重复（8/13）因在无症状男性亲属中存在而被认定为良性。两例女性（病例29和30）携带新生移码重复，确诊为有症状的DMD携带者。其中病例29携带两个不连续重复（外显子45-54和外显子63-79），虽经FISH证实位于DMD基因内，但其严重表型不能完全用携带状态解释。

该研究证实，在32例意外发现DMD-CNV的病例中，56%（18例）最终确诊为肌营养不良症或携带者，且缺失致病的比例远高于重复。值得注意的是，多数确诊患者为年轻男性，因发育迟缓等非特异性症状被转诊，突显了早期遗传验证和神经科评估的重要性。研究还发现，芯片与MLPA结果存在不一致的情况，尤其在断裂点靠近外显子-内含子边界时，强调需用第二种技术验证CNV。

此外，家系 segregation 分析在变异分类中起到关键作用：当无症状成年男性携带相同变异时，通常提示良性；但需注意年龄相关的表型外显率问题，特别是心肌病变风险。数据库查询也至关重要，但需谨慎对待历史数据中的不完整表型记录。

该研究对正在全球开展的新生儿DMD筛查（NBS）具有重要指导意义。随着DMD被纳入新生儿筛查项目，更多意外CNV将被发现。本研究提出的六步策略——MLPA验证、FISH定位、家系分析、数据库查询、神经科评估和携带者检测——为这类变异的解读提供了标准化路径。

总之，DMD基因内的拷贝数变异即使意外发现，也具有高度的临床相关性。通过综合运用分子遗传技术、家系研究和临床评估，可以显著提高诊断准确性，为患者家庭提供遗传咨询和早期干预的机会。这一研究成果为DMD的精准诊断和治疗奠定了基础。