合成抗凝剂Octaparin靶向线粒体心磷脂-GSDMD轴以拯救脓毒症中的氧化还原稳态

　　本研究针对脓毒症中免疫反应失调和线粒体功能障碍缺乏有效治疗手段的难题，研究人员开展了合成肝素类似物Octaparin靶向线粒体和氧化还原通路的研究。结果表明，Octaparin通过抑制炎症小体活化、减少GSDMD-NT线粒体定位并恢复线粒体功能，显著改善脓毒症生存率和多器官损伤。该研究为脓毒症治疗提供了同时靶向抗凝、免疫调节和线粒体保护的新型治疗策略，具有重要临床转化价值。

　　

脓毒症作为一种危及生命的综合征，其发生源于宿主对感染的失调反应，全球每年约4900万病例和1100万死亡人数，总体死亡率超过30%，严重病例甚至超过50%。尽管支持治疗有所进展，但脓毒症的高死亡率仍源于其复杂的细胞病理机制，涉及过度激活的免疫、凝血病和线粒体功能障碍之间的恶性串扰。线粒体功能障碍作为核心标志，表现为氧化磷酸化受损、活性氧（ROS）过量产生和细胞器动力学紊乱。受损的线粒体释放线粒体DNA（mtDNA）和损伤相关分子模式（DAMPs），激活如Nod样受体热蛋白结构域相关蛋白3（NLRP3）炎症小体，并驱动gasdermin D（GSDMD）介导的巨噬细胞焦亡。这种GSDMD介导的促炎性细胞死亡通路释放白细胞介素-1β（IL-1β）、白细胞介素-18（IL-18）和细胞内内容物，建立器官损伤和氧化还原失衡的自我放大循环。

当前脓毒症疗法仍不足，因其无法解决这些细胞基础问题。抗菌药物和免疫调节剂对异质性免疫反应效果有限，而代谢干预措施在临床转化中面临挑战。肝素及其类似物，包括未分级肝素（UFH）、低分子量肝素（LMWHs）如依诺肝素和合成五糖如磺达肝癸，广泛用于脓毒症中的血栓预防。临床数据表明其潜在益处，如缩短机械通气时间和重症监护室（ICU）停留时间。然而，所有当前肝素及相关类似物都存在关键局限性：UFH存在批次变异性和肝素诱导的血小板减少症（HIT）风险；依诺肝素具有降低但不可忽略的HIT风险；磺达肝癸虽具有合成纯度，但对线粒体功能障碍或焦亡通路活性可忽略。最关键的是，它们均不能减轻线粒体GSDMD易位，该过程中GSDMD的N端孔形成片段（GSDMD-NT）与线粒体外膜上的心磷脂结合，加剧细胞器损伤和炎症小体激活。

为克服这些限制，研究人员开发了octaparin，一种具有明确化学结构和一致因子Xa抑制活性的合成肝素类似物。先前工作证实，octaparin相较于传统肝素及其类似物具有更优的安全性，出血风险降低。新兴证据表明糖胺聚糖在免疫代谢过程中起调节作用。鉴于这些功能以及心磷脂（一种线粒体特异性磷脂）在锚定GSDMD-NT以启动焦亡中的作用，研究人员假设octaparin可能破坏线粒体焦亡信号从而恢复氧化还原稳态。

该研究发表于《Redox Experimental Medicine》，研究人员综合运用了多种关键技术方法：通过小鼠脂多糖（LPS）诱导的内毒素血症和鼠伤寒沙门氏菌诱导的脓毒症模型进行体内评价；使用小鼠骨髓来源巨噬细胞（BMDMs）和人急性单核细胞白血病THP-1细胞系进行体外研究；采用转录组学（RNA-seq）分析巨噬细胞免疫代谢重编程；通过蛋白质印迹（Western blot）和免疫荧光技术检测炎症小体相关蛋白表达和定位；利用线粒体分离和功能测定（包括Seahorse代谢分析）评估线粒体质量和功能；采用酶联免疫吸附测定（ELISA）和流式细胞术分析细胞因子水平和细胞表型。

Octaparin通过减轻炎症驱动的器官衰竭改善脓毒症生存率

研究人员通过比较octaparin、肝素及相关类似物的结构特征，如硫酸化模式和分子量，发现octaparin在LPS和鼠伤寒沙门氏菌刺激的BMDMs中强烈抑制TNF-α和IL-6释放，而肝素仅显示适度抑制，依诺肝素或磺达肝癸效果可忽略。在LPS攻击的小鼠中，octaparin以剂量依赖性方式改善生存率，减轻肺损伤，并降低TNF-α、IL-6、IL-1α和IL-1β的系统水平。在鼠伤寒沙门氏菌感染的小鼠中，octaparin也观察到类似的益处，包括增强生存率、减少肺损伤和抑制细胞因子释放。此外，octaparin减轻了脓毒症诱导的多器官衰竭，减少肝脏、肺和肾脏中的炎症浸润并保留组织架构，降低血清器官损伤标志物包括LDH、ALT、AST、肌酐和BUN。

巨噬细胞免疫代谢的转录重编程

通过RNA测序（RNA-seq）分析，研究人员发现octaparin处理诱导LPS激活的BMDMs转录谱的显著变化。转录组分析鉴定出5623个显著差异表达基因。KEGG和GO富集分析显示这些基因富集于脓毒症发病机制的核心通路，包括细胞因子-细胞因子受体相互作用、TNF信号传导和炎症反应等。聚焦基因集富集分析（GSEA）进一步显示octaparin下调与细胞因子活性、细胞因子结合、细胞趋化性和免疫受体信号传导相关的基因集。

增强吞噬作用而不诱导焦亡

基因本体（GO）富集分析显示，octaparin可能协调三重关系以增强吞噬作用，同时限制线粒体介导的焦亡和过度炎症反应。Octaparin以剂量依赖性方式显著增加BMDMs的吞噬活性，通过中性红摄取和鼠伤寒沙门氏菌-GFP吞噬试验验证。共聚焦显微镜图像显示octaparin处理后细胞外鼠伤寒沙门氏菌-GFP荧光强度降低，表明octaparin增强了BMDMs的细菌清除能力。同时，octaparin增强BMDMs对细菌的吞噬作用，同时减弱吞噬过程引发的焦亡。在鼠伤寒沙门氏菌感染的小鼠中，octaparin处理显著降低了肝脏、肺和肾组织中的细菌负荷。

抑制经典和非经典炎症小体

Octaparin以剂量依赖性方式抑制LPS + ATP诱导的经典炎症小体激活，表现为细胞活力提高同时LDH释放和IL-1β分泌减少。同样在LPS/尼日利亚菌素诱导的经典炎症小体激活中也观察到这种抑制效应。Octaparin还以剂量依赖性方式抑制LPS转染诱导的非经典炎症小体激活，表现为细胞活力增加和LDH释放及IL-1β分泌减少。值得注意的是，octaparin以剂量依赖性方式抑制由HMGB1-LPS复合物触发的细胞毒性和促炎反应。

心磷脂介导的线粒体GSDMD易位阻断

Octaparin抑制血浆膜破裂，并显著降低由LPS/Fugene HD、LPS + HMGB1、LPS + ATP和LPS + Nigericin诱导的BMDMs焦亡模型中碘化丙啶（PI）阳性焦亡细胞的百分比。免疫荧光结果还表明octaparin抑制GSDMD-NT的激活和血浆膜相关寡聚化。蛋白质印迹分析显示octaparin在经典和非经典炎症小体通路中抑制GSDMD切割和GSDMD-NT的产生，同时减少caspase-1和caspase-11的激活。Octaparin处理显著降低了与LPS处理组相比的Crls1和Plscr3的相对mRNA水平。从BMDMs分离线粒体组分后，发现octaparin显著降低线粒体中CRLS1和PLSCR3的相对蛋白表达，并减少焦亡期间GSDMD-NT的线粒体定位。

恢复线粒体结构和氧化还原功能

Octaparin显著改善线粒体碎片化，表现为线粒体融合增加和 elongated 线粒体比例更高，表明线粒体形态显著改善。Octaparin有效恢复LPS诱导的线粒体膜电位下降，抑制LPS诱导的线粒体超氧化物和ROS产生。通过Seahorse细胞外通量分析仪测量BMDMs的氧消耗率（OCR），发现LPS刺激显著降低OCR，而octaparin部分逆转这种下降。定量分析显示LPS损害基础呼吸、最大呼吸和备用呼吸能力，所有这些都被octaparin显著改善。相比之下，肝素、依诺肝素和磺达肝癸几乎无法逆转LPS诱导的线粒体膜电位去极化，也不能减少线粒体超氧化物或细胞内ROS的产生。

研究结论与意义

该研究确立了octaparin作为一种开创性的脓毒症治疗剂，通过同时靶向线粒体完整性和焦亡信号。Octaparin通过整合机制从根本上超越传统肝素，解决驱动脓毒症致死性的病理三重性—失调的炎症小体激活、生物能量崩溃和细胞器导向的细胞死亡。最关键的是，octaparin通过破坏心磷脂-GSDMD信号轴同时恢复氧化还原稳态来实现这一目标，将其定位为第一个将抗凝安全性与线粒体修复联系起来的作用剂。

核心机制创新在于octaparin中断心磷脂依赖性焦亡执行。心磷脂外化至线粒体外膜为孔形成GSDMD-N末端片段创建结合平台，该事件使细胞器透化并释放线粒体DNA作为有效的NLRP3激活剂。Octaparin通过下调心磷脂合成和转运基因（Crls1、Plscr3）特异性预防这种级联反应，从而将焦亡与细胞器损伤解耦。这种作用在结构上由octaparin独特的高密度硫酸化模式 enabled，可能竞争性地结合心磷脂或重塑其膜拓扑结构—一种得到硫酸化糖脂相互作用新兴证据支持的机制。传统肝素由于异质硫酸化 profile 缺乏这种精确性，解释了它们无法减轻线粒体GSDMD易位的原因。

同时，octaparin协调全面的线粒体复苏。它减弱超氧化物过量产生和细胞活性氧爆发，同时重新极化线粒体膜以恢复嵴结构。功能恢复证据是炎症巨噬细胞中呼吸能力显著增强，表明恢复的代谢灵活性以抵抗脓毒症应激。这些改进通过octaparin重编程巨噬细胞免疫代谢而放大，该重编程抑制糖酵解驱动的炎症小体启动同时增强细菌清除。这种重编程将细胞因子谱转向修复表型，破坏代谢功能障碍和炎症之间的恶性循环，该循环推动器官衰竭。

从转化角度来看，octaparin解决脓毒症管理中的关键差距。其合成生产消除了动物源性肝素固有的批次变异性和病毒污染风险，而选择性因子Xa抑制最小化出血并发症—凝血病脓毒症患者的主要限制。更显著的是，octaparin预防实质细胞中的线粒体损伤，直接保护重要器官免于坏死。这种器官保护功效延伸超出急性期管理；通过减轻免疫细胞中持续的线粒体钙处理缺陷，octaparin可能缓解困扰脓毒症幸存者的慢性免疫抑制。

该研究建立了octaparin作为脓毒症治疗的一种模式转变策略，化学上化解心磷脂-GSDMD死亡开关同时重新校准细胞生物能量学。通过同时靶向细胞器完整性、炎症小体-ROS信号串扰和免疫代谢麻痹，octaparin建立了针对脓毒症的 unified 治疗策略。该方法值得在使用线粒体损伤生物标志物分层患者的临床试验中进行临床评估。