综述：适应性癌症治疗：非遗传因素会成为其阿喀琉斯之踵吗？

　　本综述深入探讨了进化论指导下的癌症适应性疗法（AT），揭示了其通过动态剂量调整利用敏感细胞抑制耐药细胞的创新策略。文章重点剖析了肿瘤微环境（EMDR）、上皮-间质转化（EMT）及药物外排泵（如P-gp/ABCB1）介导的非遗传耐药机制，这些机制可能削弱AT疗效，并提出了联合靶向策略（如使用EMT抑制剂或假性药物Verapamil）以增强肿瘤控制的新方向。

　　

非遗传/表观遗传成分在治疗耐药中的作用

标准的最大耐受剂量（MTD）疗法若能在耐药出现和扩散前消除所有肿瘤细胞，则有可能实现彻底治愈。此类情况下的肿瘤可被视为同质性的敏感细胞群体，不存在足以引发进化救援的遗传性或新生耐药表型。与MTD治疗相反，适应性疗法（AT）在最有效时，其耐药细胞频率需超过一个最小阈值，使得MTD疗法无法清除，但在此阈值之上，耐药群体又尽可能小。

在晚期癌症中，完全的药物敏感性十分罕见。相反，基础的遗传和表型变异确保了某种程度的耐药性在治疗开始前便已存在。群体中存在的耐药突变（或其他具有适应性效应的遗传改变）使得细胞能够快速调整其转录和代谢程序以应对治疗挑战。无可否认，遗传进化在耐药亚克隆的过度生长中至关重要。

尽管如此，仅针对引起耐药的遗传事件的疗法常常失败。此外，在各种癌症中，越来越多地观察到无法识别遗传原因的 therapeutic resistance。由此可得出结论，除了遗传改变，或独立于遗传改变，非遗传进化可能是导致癌症耐药的一个重要因素。非遗传耐药可能涉及表观遗传修饰（即由DNA序列改变以外的任何方式引起的细胞表型变化）。通过异常的表观遗传调控，癌细胞利用了人类基因组中编码的大多数表型特性的可及性。这是一种非凡的能力，即使面对当前最有效的疗法也能发展出适应性策略。因此，这种耐药状态并非通过预先存在性状的遗传选择而产生；相反，这些变化是由对环境不利影响的直接反应所触发的（见下文拉马克诱导）。治疗所选择的表观遗传状态可以在一定程度上遗传给子代细胞（跨代表观遗传继承），因此，提供适应性优势的性状可能在细胞群体中持续存在很长时间。肿瘤微环境在药物存在下赋予额外的生存优势。它可能通过肿瘤-间质对话，或通过其物理（机械）特性限制药物可及性（作为非遗传且非表观遗传的效应）来诱导更具耐药性的表型。

耐药性仍然是所有癌症类型和治疗模式（包括靶向治疗、免疫治疗和化疗）面临的主要挑战。本文将探讨非遗传耐药机制，重点介绍基于化疗研究中的例子。这些主要的非遗传机制包括：（i）肿瘤微环境的保护作用，（ii）上皮-间质转化（EMT）的诱导，以及（iii）药物外排泵的过表达和传播。理解这些快速的耐药过程对于AT尤为重要，因为它们会以敏感细胞为代价增加耐药细胞群体的规模，从而降低肿瘤生长的可控性，并通过多药耐药（MDR）的发展最终导致恶性复发。

肿瘤微环境的保护作用

迄今为止，大多数实验主要关注癌细胞的内在化疗耐药性。体外实验中观察到的药物敏感性常常与所研究细胞来源的肿瘤的体内治疗反应不相关。这突显了关注单细胞反应的体外实验与癌细胞作为复杂生态系统一部分的体内状态之间的重要差异。

这个生态系统包括其他肿瘤细胞，形成群体表型组合，可通过功能选择促进肿瘤进展。它还包含微环境的多种组分，例如非肿瘤宿主细胞（如癌症相关成纤维细胞、异常血管的内皮细胞、干细胞和免疫细胞）以及它们分泌的细胞外基质（ECM）。肿瘤的微环境结构会随着血流的时空变化而改变，这可能迅速改变微环境条件、大小和空间异质性，强烈影响癌症的进化动力学。一方面，癌症生态系统包含可能有助于治疗期间癌症群体灭绝的元素。例如，已知基质细胞与肿瘤细胞竞争资源和空间。另一方面，微环境发挥着肿瘤保护作用，这种作用因化疗引起的基质应激而进一步增强。肿瘤基质的物理（机械）和生物学特性导致了环境介导的耐药性（EMDR）机制。EMDR包括细胞粘附介导的耐药性（CAM-DR），即肿瘤细胞整合素与基质成纤维细胞或ECM成分粘附，触发生存信号。此外，它还包括可溶性因子介导的耐药性（SFM-DR），涉及细胞外分泌的“公共物品”的摄取，这些物质促进增殖、侵袭和生存，培养出 therapy-resistant phenotype。这些近分泌和复杂的旁分泌串扰效应还受到其他因素的补充，例如间质液压力、机械力、ECM的组成和硬度（力诱导的耐药性）、血流减少导致的缺氧条件以及基质酶引起的药物降解。这些因素的综合影响决定了药物的可用性和作用。此外，一些微环境信号可以将癌细胞表型转向干细胞样和/或低增殖形式。由于化疗药物主要针对高度增殖的细胞（例如，通过DNA损伤诱导凋亡或抑制细胞周期进程），这些干细胞样和/或低增殖细胞对治疗的敏感性较低。

这种影响原位癌细胞敏感性的耐药策略的复杂性并非二元的（即细胞要么死亡，如果敏感；要么存活，如果耐药）。相反，敏感性存在于一个谱系上，该谱系由癌细胞及其微环境的特性共同决定。总体而言，肿瘤微环境可能提供避难所，帮助肿瘤细胞在通常致命的毒性攻击中存活下来，无论其最初对药物的敏感性如何。因此，治疗失败的原因必须在于基质细胞、癌细胞和抗癌疗法之间复杂的相互作用中。因此，新的治疗干预措施可能会结合抗癌和抗基质策略。后者包括通过增加ECM渗透性来促进治疗剂的扩散、抑制基质细胞表达/分泌的分子以及限制上皮-基质相互作用。可以看出，这些治疗的潜在目标不是直接最大化肿瘤细胞消除，而是增强AT的有效性，以实现对肿瘤负荷的更好控制。

上皮-间质转化（EMT）

EMT是胚胎组织形态发生和伤口愈合过程中的一个关键细胞程序，其中上皮细胞失去其顶基极性和细胞间（以及细胞-基底膜）连接，转变为纺锤形的间质表型。EMT的非遗传性质由其可逆性（见间质-上皮转化（MET））和已绘制的相关表观遗传调控所证明。在癌症中，EMT的重编程事件被异常激活，不仅导致获得增强的肿瘤起始和转移潜力，还增加了对各种治疗攻击的抵抗力。

这种复杂的耐药性可归因于EMT相关干细胞样特征的获得。因此，这些细胞通常被定义为癌症干细胞（CSCs），其特征是增强的生存能力和产生复杂肿瘤组织的独特能力。CSC的治疗耐药是多种因素的结果，包括药物外排泵表达增加、DNA损伤的预防和修复能力增强、醛脱氢酶活性、自噬增强以及生存促进信号通路（如Wnt、Notch和Hedgehog）的过度激活。

EMT很少是完全的，相反，沿着上皮-间质谱系会发展出具有混合特性的准间质表型。EMT由缺氧、先天性和适应性免疫反应、肿瘤环境的旁分泌信号以及抗肿瘤药物治疗诱导。此处我们关注紫杉醇（Paclitaxel），它在一个小鼠模型的AT方法中延长了无进展生存期，该模型将MDA-MB-231乳腺癌细胞原位植入乳腺脂肪垫。效果最好的AT策略保持了治疗频率，但剂量是达到肿瘤反应所需的最低剂量。在这项研究中，AT的初始紫杉醇剂量设定为20 mg/kg。如果肿瘤缩小20%或更多，剂量减少50%。当肿瘤生长20%或更多时，剂量增加至先前剂量的50%（标准疗法：20 mg/kg紫杉醇，每周两次，持续2.5周）。其他研究描述了紫杉醇治疗在MDA-MB-231异种移植小鼠模型中诱导了EMT（和CSC表型）。紫杉醇治疗联合Eribulin（MET诱导剂）或TGF-β I型受体激酶抑制剂EW-7197，减少了在体外和体内MDA-MB-231细胞中观察到的EMT事件。有趣的是，两项研究在体内均使用了10 mg/kg的紫杉醇剂量（与EMT抑制剂联合），强烈表明相对低剂量的化疗剂即可激活EMT程序。尽管这些小鼠模型的可比性需谨慎对待，但我们可以得出结论，EMT可能是一个显著事件，会降低低剂量AT的有效性。然而，使用EMT抑制剂可能是延迟细胞表型向耐药方向转变的潜在解决方案。

药物外排泵及其向其他细胞转移的机制

药物外排泵的任务是将细胞内药物/毒素积累降低到亚致死水平（它们存在于正常组织如肾脏和肠道中，作为对血液中或摄入毒素的保护机制）。在癌症中，过表达的药物外排泵会排出大量结构和功能多样的药物（因此称为MDR），严重限制了治疗效果。研究最广泛的MDR转运蛋白属于ATP结合盒（ABC）转运蛋白超家族，包括P-糖蛋白/P-gp（MDR1或ABCB₁）、多药耐药相关蛋白1/MRP1（或ABCC₁）和ABCG₂（或BCRP）。MDR介导的药物外排是ATP依赖性的；例如，P-gp和大多数其他膜泵每次排出一个药物分子大约消耗2个ATP。因此，在资源有限的情况下，细胞会将能量从增殖等次要过程转移出来，优先保证生存。由于泵的持续运行，这种能量重排在AT的治疗间歇期也会维持，因此耐药细胞将面临与适应性更好的敏感细胞相比的增殖劣势。

以前认为，一小部分使用药物外排泵的细胞可以根据达尔文原则适应治疗压力，导致其扩张（“选择和扩张”模型）。然而，多个研究组表明，拉马克诱导也参与了耐药细胞群体的富集。拉马克适应的驱动力是表观遗传可塑性（细胞响应内部或外部刺激以一定程度的遗传性改变其表观遗传状态的能力）。药物诱导的拉马克适应比遗传进化快得多。例如，在用低剂量长春新碱治疗期间，表达MRP1的HL60急性髓系白血病细胞百分比在24-48小时内从约2%增加到30-40%。在肉瘤患者肺部转移组织中，阿霉素给药后50分钟，P-gp/MDR1 RNA水平显示出强烈增加（3-15倍），可以假设存在类似现象。药物外排泵的过表达与经历EMT的CSCs有关。化疗诱导的药物泵表达增加是否可以独立于EMT发生，或者是否需要一定程度的上皮-间质表型谱系转变，仍有待解答。

非遗传耐药快速传播的一个有趣例子是通过分泌的细胞外囊泡（EVs）在无关细胞之间水平转移生存能力。EVs是细胞间通讯者，其 cargo（如生物活性蛋白、脂质和核酸）受到脂质双层的保护，免受细胞外空间的降解作用。最近，围绕EVs表面形成的生物分子电晕被证明是重要的外部EV cargo。EVs在从肿瘤发生到转移形成的整个致癌过程中发挥着主要作用，包括耐药性的发展。后一过程可能涉及多因素机制，参与逃避药物诱导的细胞死亡，例如通过将药物包装到EVs中将其从细胞质中移除、在癌细胞之间传递抗凋亡分子以及传递信号使基质细胞促进耐药。EVs传递复杂的分子 cargo 包，这些调节因子共同塑造了受体细胞的适应性特性。例如，非编码RNA（即miRNA、lncRNA和circRNA）调节靶细胞中的基因表达朝向耐药表型，例如通过促进EMT、自噬、诱导CSC状态以及影响DNA修复途径。这里，我们关注EVs将药物外排泵和mRNA（其产物是泵蛋白）从耐药细胞传递给其药物敏感对应物的能力。功能的药物外排泵，如P-gp、MRP1和ABCG₂，已在EVs中被检测到。药物外排泵的转移涉及包含整合泵蛋白的供体细胞膜部分出芽，导致EV生物发生。EV携带的外排泵蛋白（如P-gp）被转移到受体细胞膜上，在那里它们可以发挥作用并诱导MDR表型。此外，小EVs可以通过转移P-gp和P-gp mRNA来促进受体细胞的耐药性。假设地，基于EV的药物外排泵水平转移可以在治疗期间保留一部分遗传多样性，因为在其帮助下，疗法在独立谱系中选择相同的表型。

一个规避癌细胞化疗耐药的潜在机会是同时施用化疗剂和 efflux pump substrates（作为竞争配体的假药物），以增加实际药物的细胞内积累。这些底物的剂量限制限制了这些方法的可行性。例如，维拉帕米（Verapamil），一种P-gp底物，需要微摩尔浓度（体外约10μM），这在临床环境中是无法实现的（临床试验中观察到的最大浓度为0.5μM）。这些底物的另一个特点是，它们可以通过增加药物外排泵的ATP依赖性外排活性来最大化细胞的耐药成本。这种效应在资源有限的环境中更为明显。2-脱氧葡萄糖（一种不可代谢的葡萄糖类似物）处理会导致亚生理葡萄糖浓度。当与2-脱氧葡萄糖一起应用时，维拉帕米降低了阿霉素耐药细胞在体外增殖的能力。基于此体外实验的计算模型显示，假设患者使用AT（与阿霉素MTD治疗相比），无进展生存期（PFS）可提高2至3倍。当AT辅以维拉帕米和2-脱氧葡萄糖时，PFS提高了4至10倍（取决于化疗耐药亚群的大小）。

结论性评述

尽管关于化疗的最初研究已经揭示了治疗效果的暂时性（例如Sidney Farber等人1948年的研究），但治疗耐药的根本原因只有在将癌症置于进化框架内审视时才变得清晰。这种范式的转变主要始于John Cairns 1975年的开创性工作，该工作描述了突变肿瘤细胞的选择机制与经典达尔文进化论相似，并在后来被Peter Nowell 1976年的克隆进化模型所扩展。癌症的进化观点并未被广泛接受。当前的标准护理实践继续使用尽可能高的剂量来杀死最大数量的癌细胞——这种方法在进化上通常是不明智的。MTD的概念如此深入地融入了药物研究，以至于I期试验的目标之一明确是确定患者能够耐受的最大剂量毒性，该剂量随后用于所有后续研究。因此，关于低剂量治疗中发生的生物过程的数据有限。癌症治疗的研究愿望仍然集中在发现“神奇子弹”，即能够在不伤害健康细胞的情况下根除所有癌细胞的药物，最终实现癌症的治愈。正如本文所讨论的，肿瘤的进化救援阻止了以最大耐受剂量使用的化疗药物成为神奇子弹。在姑息性临床环境中，如在大多数转移性癌症中——这几乎总是致命的——追求MTD治疗不仅是徒劳的，而且给患者带来了显著的毒性。AT似乎具有延长肿瘤控制同时使用更少药物以减少毒性的好处。重要的是，只要敏感群体足够大，能够竞争性抑制耐药细胞的生长，AT就可以维持肿瘤控制。因此，敏感向耐药的表型变化极大地影响了AT的有效性。此处描述的现象在治疗后数小时内迅速将初始克隆组成转向耐药表型，从而减少了可被治疗控制的群体规模。尽管，根据临床前研究和计算模型，这种转变可以通过药理学方法减缓。需要注意的是，大多数旨在防止耐药表型发展的实验通常专注于单一药物，或其与以MTD给药的化疗药物的组合。需要进一步的研究来阐明这些过程的时空进程如何受到调节时机和治疗剂量的影响，以及AT是否对肿瘤细胞施加了更广泛的选择压力。此外，通过辅助疗法靶向导致敏感向耐药表型转变的过程，AT可以触及更多敏感细胞，因此可能比单独化疗更有效。将先进的人工智能驱动的预测模型整合到AT协议中可以进一步提高治疗的精确度，通过将敏感向耐药的表型转变纳入预测框架来实现额外优化。因此，AT可能通过适度减少敏感群体来实现更稳定的疾病控制，并更有效地引导肿瘤达到期望的进化状态。