人血浆中秋水仙碱的快速简便 UHPLC-MS/MS 测定方法的开发与验证及其在家族性地中海热患者治疗药物监测中的应用研究

　　本研究开发并验证了一种快速、高灵敏度的液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）方法，用于定量人血浆中的秋水仙碱（COL）。该方法采用一步式提取技术，仅需50μL样本量和3分钟分析时间，严格遵循ICH M10指南完成验证，在线性范围（0.05–100 ng/mL）、精密度、准确度和稳定性等方面表现优异，为临床治疗药物监测（TDM）和剂量调整提供了可靠工具。

　　

方法开发与优化

秋水仙碱（COL）是一种源于秋水仙属植物的天然生物碱，是治疗痛风、家族性地中海热（FMF）及心包炎的一线药物。由于其狭窄的治疗指数和潜在的药物相互作用，精确的血药浓度监测在特定临床场景中极为重要。尽管已有多种分析方法被报道，但大多数方法因样本需求量大、分析时间长或前处理复杂而难以满足临床高通量检测的需求。

本研究旨在建立一种灵敏、快速且样品需求量低的LC-MS/MS方法，用于人血浆中COL的定量分析。采用Ostro 96孔板进行一步式提取，同步实现蛋白沉淀和磷脂去除，大幅简化样本前处理流程并提高重现性。该方法选用稳定同位素标记的COL-d₃作为内标（IS），有效提升定量的准确性与精密度。

质谱检测在电喷雾正离子（ESI+）模式下进行，通过多反应监测（MRM）模式采集COL（m/z 400.2→358.2/326.2）和COL-d₃（m/z 403.3→361.3/313.2）的离子对。色谱分离使用ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱（50 × 2.1 mm, 1.7 μm），以10 mM甲酸铵水溶液和乙腈为流动相进行梯度洗脱，可在3分钟内完成分析，COL与COL-d₃的保留时间均为1.36分钟。该方法仅需50 μL血浆样本，适合临床大规模样本分析。

方法验证

该方法根据ICH M10和EMA生物分析方法验证指南进行全面验证。结果显示，该方法在0.05–100 ng/mL范围内线性良好（r2 ≥ 0.99），最低定量限（LLOQ）为0.05 ng/mL，信噪比（S/N）大于10。日内与日间精密度（CV%）均低于11.9%，准确度在101.4%–105.2%之间，完全符合指南要求。

选择性试验证实，空白血浆中内源性物质对目标物及内标均无显著干扰。稀释完整性试验表明，样本可在超出定量上限（ULOQ）时经10倍稀释后准确检测（准确度92.8%，CV 1.6%）。残留测试未发现明显携带污染。

基质效应评估显示，IS归一化基质因子在不同来源血浆中变异系数（CV）小于15%，表明离子抑制或增强效应得到有效控制。COL的提取回收率超过80%，虽未完全回收但表现出高度一致性（CV < 8.6%）。稳定性试验证明，COL在血浆中经历短期室温放置、三次冻融循环、自动进样器内存放以及长期-20°C储存后仍保持稳定，准确度始终保持在可接受范围内。

方法应用

经验证的方法成功应用于8例FMF患者血浆样本的分析。患者每日口服COL剂量为1–2 mg，采血时间点为服药后1.5–5小时。测得血浆COL浓度范围为0.37–3.15 ng/mL，中位值为1.29 ng/mL，与既往研究结果一致（Canbolat, 2022）。值得注意的是，不同个体间血药浓度差异显著，例如最高值与最低值相差近十倍，凸显了在特定人群（如肝肾功能异常或老年患者）中开展治疗药物监测（TDM）的必要性。

研究表明，COL的有效血药浓度范围约为0.5–3 ng/mL，超过3 ng/mL时可能出现毒性反应，表现为腹痛、呕吐、腹泻及出血等不良反应。本研究建立的方法灵敏度高、操作简便、分析速度快，可为临床提供可靠的COL浓度监测工具，辅助医生进行个体化给药调整，提升治疗安全性与有效性。

结论

本研究成功开发并验证了一种适用于临床常规监测的LC-MS/MS方法，用于定量人血浆中的秋水仙碱。该方法在样本量、分析速度、选择性和灵敏度方面均具有显著优势，严格遵循ICH M10标准完成系统性验证，并初步应用于FMF患者的治疗监测中。该方法的建立为COL的临床药代动力学研究、治疗窗界定以及个体化用药提供了强有力的分析支持。