利用新型光谱流式细胞术组合监测多发性硬化治疗相关受体表达动态变化

　　本文推荐一篇创新性研究，开发了首个24参数光谱流式细胞术组合，用于系统性监测多发性硬化（MS）患者全血中治疗相关受体（如CD20、CD49d/VLA-4、S1PR1等）的表达动态。该研究证实受体表达存在显著个体差异，且基线表达水平与疾病修饰治疗（DMT）反应相关，为MS精准医疗（如Ocrelizumab、Natalizumab等治疗方案选择）提供了重要技术支撑和理论依据。

　　

1 引言

精准医疗在改善多发性硬化（MS）治疗效果方面日益重要。MS是一种慢性免疫介导的自身免疫性疾病，以自身反应性T细胞和外周炎症免疫细胞持续浸润中枢神经系统（CNS）为特征。目前MS尚无治愈方法，主要依赖疾病修饰治疗（DMT），多数治疗方案通过修饰或删除特定免疫细胞群发挥作用。这些细胞群体表达关键的MS治疗相关受体，且表达水平存在个体差异，导致药物疗效因人而异。近年来研究发现，基线免疫细胞群体水平（如效应CD4⁺ T细胞较低）与对二甲富马酸（DMF）的更好反应相关，但循环T细胞亚群的药效学分析与阿仑单抗疗效无关。除细胞群体外，治疗相关受体的丰度也可能直接影响药物相互作用，因此监测这些受体表达对治疗决策具有重要价值。

2 材料与方法

研究获得新西兰健康与残疾伦理委员会（HDEC）批准。纳入13名健康参与者和12名新诊断未接受治疗的MS患者。所有参与者通过静脉穿刺采集EDTA抗凝全血，并在75分钟内完成染色和光谱流式细胞仪（Cytek Aurora）采集。抗体滴定采用100μL全血进行，通过染色指数（SI）和分离指数优化抗体-荧光染料组合。样本制备采用直接全血染色方案，加入抗体 cocktail 后避光孵育，随后裂解红细胞并固定细胞。采用CytoNorm算法对照冻存PBMC进行数据标准化，以降低批间变异。相似性指数（SI）和复杂性指数依据Cytek推荐方法计算，确保荧光染料组合的独特性。生物信息学分析采用R语言ggplot2包，统计分析和作图使用GraphPad Prism 7完成。

3 结果

3.1 组合设计

本研究开发了针对12种MS治疗相关受体的免疫表型分析组合，其中5种（HLA-DR、CCR2、CCR7、CD62L、CD20）为组成型表达，7种（CD49d、S1PR1、S1PR4、CD64、CD80、CD86、CD52）为新验证可可靠检测的标志物。这些受体在淋巴细胞和单核细胞上表达异质性显著，根据预期表达密度（1°、2°、3°）配对不同亮度荧光染料。组合优先针对T细胞亚群，同时涵盖B细胞（如CD20⁺）和单核细胞亚群（经CD14、CD16、CX3CR1、CCR2定义）。最终组合包含24种标志物-荧光染料组合，详细试剂信息见表4。

3.2 组合与参照对照优化

通过考虑溢出扩散矩阵（SSM）和共表达标志物，尽可能降低治疗相关受体与谱系标志物间的相似性指数。尽管全染色样本分辨率部分损失，细胞群体仍得到良好解析。为获取高质量单染对照，对健康供体全血采用PMA和离子霉素刺激，以增强CD80、CD86、S1PR1和S1PR4等低表达受体的信号。

3.3 单管染色方案

采用直接全血染色流程，省略死细胞鉴别标记，依靠快速处理（<75分钟）保证高细胞活性。通过侧向散射（SSC-B和SSC-V）特性排除残留红细胞、死细胞和碎片，并通过N×N图确认解混效果。

3.4 治疗相关受体可变表达的检测

MS患者与健康对照者在白细胞总数、粒细胞、淋巴细胞和单核细胞比例上无显著差异。利用本组合可靠检测到B细胞、T细胞和单核细胞的所有免疫细胞亚群，其频率多在健康 donor 范围内，但 na?ve B细胞、CD8⁺ T细胞和中间单核细胞在MS队列中变异性更高。受体表达检测显示，CD49d、CD52、S1PR1、S1PR4、CD80、CD86和CD64在MS患者中表达水平各异（图2A）。与健康对照相比，MS队列受体表达整体无显著差异但略高，非度量多维尺度（NMDS）分析提示两组受体表达谱存在分离（图2C）。气泡图可视化显示个体间受体表达差异显著，例如参与者33和34高表达CD49d但低表达S1PR1/S1PR4，而参与者66和68高表达B细胞和单核细胞活化受体（图2D），提示个体化治疗潜力。

3.5 基线受体表达可能指示治疗反应

所有MS患者开始Ocrelizumab（抗CD20）或Natalizumab（抗CD49d/VLA-4）治疗。Ocrelizumab治疗显示，基线CD20高表达者（红色）在12个月随访时B细胞完全耗竭，而低表达者（黑色）仅部分耗竭（图3A-C）。Ocrelizumab还降低CD3⁺ T细胞上的CD20表达，但不影响其他治疗相关受体（图3D）。Natalizumab治疗中，基线CD49d高表达者（深蓝）治疗6个月后受体下调（浅蓝），伴随白细胞计数轻度升高，符合药物作用机制；低表达者（黑色）变化不明显（图3E-G）。这些结果强调基线受体表达水平可能与治疗反应相关，支持基于受体表达谱的个体化治疗策略。

4 讨论

本研究建立了一个24色流式细胞术组合，可区分血液白细胞亚群并检测12种MS DMT靶向的治疗相关受体。组合开发遵循OMIP严格流程，成功在健康和MS未治疗者中检测到22种细胞亚群。尽管MS与健康对照在细胞频率上无显著差异，但受体表达谱的NMDS分离提示生物学差异。研究发现CD80⁺ B细胞与残疾评分（EDSS）正相关，且MS患者中增高，与既往研究一致。本组合的创新性在于同步监测多受体表达，覆盖低至高表达范围，适用于治疗随访中表达降低的场景。小样本量限制统计效能，但个体表达差异趋势支持个性化治疗潜力，如高CD49d表达者或更适合Natalizumab治疗。单管染色方案和标准化流程表明该分析有望整合入临床实践，用于识别低/高表达者以指导DMT选择。