综述：小耳畸形治疗的创新方法：组织工程和支架设计的进展

　　本综述系统探讨了小耳畸形治疗的创新策略，重点聚焦于组织工程和支架设计的最新进展。文章深入分析了当前黄金标准Nagata技术的局限性（如高侵入性和美学结果不稳定），并全面评估了生物假体（如MEDPOR?）和新兴技术（如3D打印、脱细胞支架和生物墨水）的潜力与挑战。中心思想在于通过优化细胞来源（如自体软骨细胞或间充质干细胞（MSCs））和仿生支架制造，旨在实现兼具优异美学和功能效果的个性化耳廓再生，为先天性耳畸形患者提供更优的解决方案。

　　

Innovative Approaches in Microtia Treatment: Advancements in Tissue Engineering and Scaffold Design

引言

小耳畸形（Microtia）被公认为最常见的耳部先天性畸形。根据国际小耳畸形与闭锁工作组的定义，其表现为耳廓小而畸形，常伴有外耳道狭窄或闭锁。该畸形在先天性残疾中位列前十，发病率为每5500至26000名活产婴儿中有1例。耳廓畸形可作为独立病症出现，也可作为一系列综合征（如Goldenhar综合征、Treacher-Collins综合征）的一部分，其严重程度从轻度异常到耳廓完全缺失不等。

其病因在很大程度上仍属未知，但已识别出一些围产期风险因素，如多胎、母亲年龄≥35岁、城市居住、男性、出生体重<2500克、胎龄<38周，以及在西班牙裔和亚洲人群中更高的患病率。遗传因素也与多种综合征密切相关。

目前尚无统一的分类系统，但多种分类法提供了不同视角。Marx分类分为四級（I级：耳廓略小；II级：小且结构发育不全或缺如；III级：软骨残迹；IV级：无耳畸形）。Tanzer分类更为详细，分为五型。Nagata分类侧重于手术需求，但缺乏清晰的严重程度分层。Apellaniz分类系统则结合了手术需求和临床表现，分为五类，并包括了需要特殊手术方法的综合征型小耳畸形。HEAR MAPS系统采用多学科方法，整合了解剖、功能和放射学改变。

当前的小耳畸形治疗观点

面部对称性在现代社会至关重要，对称的脸庞通常获得更高的吸引力评分。因此，小耳畸形患者常面临焦虑、抑郁和孤独感等心理社会挑战。

Nagata技术被广泛视为治疗的“金标准”。

该两步法手术采用自体肋软骨进行耳廓重建。第一步是获取并雕刻自体肋软骨移植物，以复制耳廓的主要解剖结构（采用第6覆盖第7肋软骨的技术）。第二步是将耳廓植入物从头部分离并抬高，以获得更逼真的形态。

然而，Nagata及其他自体软骨重建技术存在显著缺点。它被认为是一种高侵入性手术，伴有手术部位慢性疼痛、皮瓣坏死、支架外露、肋架构塌陷、感染和持续吸收风险的显著风险。此外，该技术的美学效果多变，高度依赖外科医生的技能。

通过种植学实现的耳廓假体

耳廓假体是另一种可行的治疗选择。这些假体为因创伤、癌症或先天性疾病导致的耳部异常提供了美学解决方案。3D扫描、计算机辅助设计（CAD）和计算机辅助制造（CAM）等技术的进步显著提高了假体的准确性。使用过程的关键步骤包括切除所有残余的小耳畸形软骨，将锚定体固定在颞骨上并穿出皮肤，然后制作对侧耳的镜像模型并通过磁性组件连接。

尽管患者满意度通常较高，但需考虑诸多因素：锚定体周围常有浆液引流并产生异味，因此需要严格的清洁和维护；患者在运动和夜间需取下假体，并注意下颌运动以防脱落；此外，由于颜色不匹配，假体通常每2-3年需更换一次。

寻求更佳美学效果的替代治疗

在过去一个世纪中，高密度多孔聚乙烯（MEDPOR^?）已成为小耳畸形耳廓重建的一种有前景的治疗替代方案。这种合成生物相容性材料的显著优势在于无需获取自体软骨，从而降低了胸外科手术的风险。此外，可同期进行骨桥植入以解决相关的听力障碍。

尽管优势明显，MEDPOR^?植入物的应用并非没有并发症。植入技术需要多次手术以用皮瓣和皮肤移植物覆盖装置，这可能导致局部皮肤坏死、感染和设备挤出。有时需要从腹部或颈部获取皮片来覆盖植入物表面。这些因素增加了重建过程的创伤，且此类手术的长期结果仍不确定。

为了增强这些设备的性能，已采用组织工程方法对MEDPOR^?进行涂层。动物模型中的初步研究表明，弹性软骨与MEDPOR的结合产生了有希望的结果，可能减少副作用并改善未来临床应用的效果。

组织工程作为小耳畸形的创新解决方案

组织工程的原则基本 straightforward。该生物医学领域中的大多数组织再生方案遵循三个主要特点：1）需要一个临时支架来支持细胞附着、增殖和代谢活动。材料选择必须考虑目标再生天然组织的机械性能、物理化学组成和微观结构。2）选择合适的细胞进行接种至关重要。深入了解组织学，尤其是再生的功能需求，对于有效地选择和将细胞接种到支架中至关重要。主要目标是将正确的细胞放置在正确的支架中，使细胞能够附着在材料上、增殖、产生细胞外基质（ECM）蛋白并最终促进再生。3）可采用分子增强来优化过程。通过掺入营养浓度、分化分子、生长因子、信号因子等成分，支架可以增强细胞功能或促进细胞分化。

1997年，Cao等人成功地在裸鼠背上培育出人耳形状的软骨，这标志着该领域的革命性发现。此后，组织工程已成为再生弹性软骨的一条充满希望的道路。大量关于耳廓工程的体外和体内研究证明了耳廓形状和软骨组织学的再生，但无一能成功长期维持耳廓结构。因此，探索促进耳廓形态长期保存的新型组织工程技术至关重要。

解剖学挑战： Navigating the Complexity of Ear Architecture

如前所述，耳廓的解剖结构非常复杂。传统上，耳廓被描述为一个薄、椭圆形、富有弹性的结构，具有各种隆起和凹陷。耳廓表面包括耳轮、对耳轮、耳屏和对耳屏，以及三个凹陷：舟状窝、三角窝和耳甲腔。为了更精确的描述，通常绘制七条假想线作为参考来描述耳朵及其与头部的关系。

新生儿中，从耳顶到耳底的最长线平均距离为36.39毫米，称为容貌耳长（PAL）。与此线正交的是容貌耳宽（PAW），最大值为23.69毫米。其他关键测量包括形态学耳长（MAL，平均24.06毫米）、形态学耳宽（MAW，平均24.9毫米）、耳垂长度（LAL，平均10.3毫米）和耳垂宽度（LAW，平均13.67毫米）。头耳距离（CAD）为6.37毫米，耳颅角通常与头皮呈4.64°倾斜。

耳廓发育迅速，在一岁内达到总长度的90%。到10岁时，女性平均尺寸约为59.0x32.5毫米，男性约为63.5x35.3毫米，达到最终尺寸的99%。因此，理想的支架应复制对侧耳的隆起、凹陷、宽度、长度和角度，以增强面部对称性。

组织学见解： Understanding the ECM of Elastic Cartilage

软骨是一种特殊形式的结缔组织。根据构成细胞外基质（ECM）的蛋白质不同，软骨分为三种类型：透明软骨、纤维软骨和弹性软骨。耳廓软骨（图4）被归类为弹性软骨，其包含的ECM蛋白质执行着特定功能。

其组成约73%水、15%胶原蛋白、9%蛋白聚糖、5%多粘附蛋白和3-5%细胞。软骨中存在多种类型的胶原蛋白，但只有II型、VI型、IX型和X型被认为是软骨特有的。值得注意的是，II型胶原（图4）、I型胶原和弹性蛋白构成了弹性软骨ECM中的大部分纤维。糖胺聚糖，如硫酸软骨素和硫酸角质素，是重要组成部分，它们组合形成聚集蛋白聚糖。

这种复杂的解剖结构产生了独特的机械性能。耳廓的平均杨氏模量为1.66 MPa，但根据解剖区域不同而有所变化。最高模量出现在耳甲腔（2.08 MPa）和对耳屏（1.79 MPa），而最低模量出现在对耳轮（1.71 MPa）、耳屏（1.67 MPa）和耳轮（1.41 MPa）。

传统上，软骨被归类为源自中胚层的组织（图5），表明软骨形成始于间充质干细胞（MSCs）。这些MSCs分化为软骨祖细胞，其具有MSCs的标志特征，包括塑料附着能力以及成脂、成骨和成软骨分化潜能。软骨祖细胞表达特定的表面标志物，如CD44+和CD90+，表明其高增殖能力。

然而，最近的单细胞RNA测序结果揭示了耳廓弹性软骨的外胚层起源。具体来说，神经嵴细胞已被证明具有分化为间充质细胞的潜力，随后成熟为软骨细胞。这一发现表明耳廓软骨可能并非 solely 源于中胚层MSCs，也可能受到神经嵴来源祖细胞的影响。

无论其胚胎起源如何，成软骨细胞和软骨细胞代表了软骨发育的终末或成熟阶段。软骨细胞是成熟软骨内的主要细胞类型，位于称为陷窝的致密蛋白质网中，有助于组织并维持ECM。这些陷窝的聚集形成了软骨功能所必需的复杂三维结构。

软骨是一种无血管结构，这意味着它不含血管，营养和氧气不通过毛细血管到达。此外，软骨具有无神经特性，意味着该组织没有神经，软骨本身对疼痛不敏感。因此，其营养依赖于扩散过程，该过程因软骨类型而异。在弹性软骨中，一层称为软骨膜的薄结缔组织层履行此功能。此外，不同类型软骨的有限再生能力阻碍了损伤后的有效组织修复。值得注意的是，自体软骨重建过程中观察到的一些不良结果可能与所涉及细胞的起源有关。弹性软骨和透明软骨在胚胎起源上的差异可能解释了导致重建耳吸收和机械性能改变的组织学不匹配。

什么是再生耳廓支架的最佳软骨细胞来源？

在确定了组织背景后，下一步是确定理想的细胞类型。最显而易见的选择是软骨细胞，其主要来源是在小耳畸形自体重建过程中获得的残余软骨。这个相对简单的来源提供了同源和自体细胞，理论上减轻了免疫学问题。正常软骨细胞和小耳畸形软骨细胞之间的基因型比较显示出高度相似性，进一步支持了它们在再生方案中的使用。

然而，必须注意的是，软骨细胞，包括来自小耳畸形软骨的细胞，在二维培养中容易去分化。这种去分化过程影响所有类型的软骨细胞，并改变其表型谱，导致III型胶原的过度表达，这是该过程的典型标志。尽管如此，小耳畸形软骨细胞已证明在三维软骨形成支架系统中具有表型再分化的潜力。

一个有趣的考虑是是否可以使用替代的软骨细胞来源。各种软骨结构提供了细胞获取的潜在选择。从气管、关节、鼻中隔和肋骨收获的软骨细胞已被接种到支架中，以基于ECM产生、基因表达和细胞活力评估其再生能力。结果表明这些来源可能可用于耳廓支架。然而，至关重要的是要认识到弹性软骨的组织学与大多数描述的来源不同，并且这些替代组织的软骨细胞可能倾向于产生透明或纤维ECM。如果发生这种情况，可能会重新引入与小耳畸形重建相关的一些初始挑战，例如定义丧失、刚性增加或植入物吸收（表2）。

此外，未分化的细胞可能代表一个有希望的替代方案。间充质干细胞（MSCs）或诱导多能干细胞是耳廓再生的可行选择。这些细胞具有自我更新特性，更重要的是，具有分化为成骨细胞、脂肪细胞和成软骨细胞的能力。目前的发现表明它们能够在支架内扩增和分化；然而，所涉及的方法仍然昂贵，对临床应用构成挑战。

表2. 软骨重建策略。该表全面概述了支架设计和应用，详细说明了每种方法所使用的材料、细胞来源以及相关的优缺点和参考文献。（注：此处省略表格具体内容，因其为列举式数据，在归纳总结中不逐项复述）

支架：再生医学中的重要工具

支架的选择与细胞的选择同样关键。因此，科学界探索各种制造技术和多种材料，以有效复制弹性软骨的ECM。

例如，脱细胞化（图6A）过程涉及从ECM中去除所有细胞成分。通过机械、化学或物理方法，去除天然细胞，同时保留特定的局部组织特性。保留组织学形态、机械性能、ECM组成和信号分子，产生一个为细胞接种做好准备的支架，便于生物人工器官的再生。此外，这些特性由于脱细胞支架内的天然成分而增强了细胞性能，这可能有助于再生。

然而，如前所述，个体间耳廓独特的解剖变异带来了挑战；使用来自不同供体的耳组织可能导致面部对称性不匹配。一个潜在的解决方案是将脱细胞ECM与其他制造技术相结合。

随后，细胞再植成为下一个关键步骤。由于支架的微观结构，细胞从外围向支架更深区域的定植是复杂的。虽然这些微观结构有助于保留许多天然特性，但它们也限制了软骨细胞的迁移，阻碍了它们渗透到支架中。此外，保留血管的能力是脱细胞技术的一个有趣方面。尽管脱细胞可以维持血管ECM，但这一特性在耳廓工程中相关性较低，因为耳廓软骨是一种无血管组织。此外，脱细胞支架可能由于原始组织中残留的DNA而引起不良免疫反应。因此，在临床转化和应用之前，评估其在活体中的安全性和免疫原性至关重要。

使用增材制造技术制作个性化支架

增材制造方法是另一种生成支架的合适技术（图6B和C）。制造过程始于图像采集。计算机断层扫描（CT）利用辐射捕获不同横截面的图像，这些图像随后可被处理成三维模型。CT在医院中广泛可用，使该技术成为图像采集的可及来源。获得的图像需要进行后处理以生成功能性的3D模型，这需要熟练的操作员来优化最终形态。

图像采集的另一种方法是使用商业3D扫描仪。这些扫描设备配备专用软件，可以对从不同角度和距离相对于目标物体收集的数据进行对齐。这种能力简化了工作流程，减少了操作员依赖性变异，并使过程更加用户友好。与CT不同，商业扫描仪仅限于外部结构。这一限制在耳朵再生中很重要，因为它必须考虑非软骨结构，如耳垂，这可能会由于皮肤宽度导致更厚的3D模型。此外，3D扫描技术的高成本可能是一个障碍。一个有趣的替代方法是摄影测量建模，它允许使用任何相机（包括智能手机中的相机）进行图像采集，并通过专用软件进行处理。这种方法减少了对昂贵扫描仪的需求，并且智能手机技术的广泛普及使其成为建模的可及选择。

无论采用何种图像采集技术，3D模型都可以高度个性化。一个称为镜像的过程可用于为小耳畸形患者生成对侧耳，从而增强面部对称性。一旦3D模型准备就绪，下一步就是根据CAD-CAM指令打印耳朵，材料被逐层沉积，直到最终支架完成。通常使用生物打印机或熔融沉积建模（FDM）打印机。

生物打印过程涉及创建生物墨水，将细胞封装在水凝胶中以用于3D结构。一种能够控制细胞类型、ECM组成以及所有组件空间关系的方法的概念，使生物打印成为再生复杂组织学结构的一种强大且有前途的工具。尽管生物打印支架提供许多优势，但它们缺乏结构稳定性。该技术的一个显著限制是无法为大型或复杂的解剖结构提供足够的支撑。因此，尝试使用这种方法再生耳廓的研究难以维持耳廓形状，导致结构收缩和耳廓形态丧失。为了解决这个问题，将生物打印与聚己内酯（PCL）支架合成相结合已成为一种有前途的解决方案。尽管该技术已成功实施，但美学效果未达预期，需要改进模型准确性以评估其再生人耳廓的潜力。

生物墨水的替代方案是使用生物相容性聚合物。各种聚合物可用于FDM，其中PCL是最常用的之一，因为它已获得美国食品药品监督管理局（FDA）批准用于临床。在耳廓重建中，一项转化研究使用了PCL与聚乳酸（PLA）和聚乙醇酸（PGA）的组合。首先，通过计算机断层扫描生成健康耳朵的3D模型。随后，打印一个PCL网格，周围包裹着无纺PGA纤维，并涂覆PLA。最后，将支架接种从