工程化BMP2-利塞膦酸盐复合物实现持续释放以增强骨质疏松治疗

　　本研究针对骨形态发生蛋白2（BMP2）临床应用中的突发释放和副作用问题，创新性地构建了BMP2与利塞膦酸盐的离子复合物，结合透明质酸（HA）和泊洛沙姆407（P407）混合水凝胶，实现了BMP2的持续释放，显著增强了体外成骨分化和体内异位骨形成 efficacy，为骨质疏松的局部治疗提供了新策略。

　　

骨质疏松症是一种全球性的健康问题，其特征是骨密度降低和骨微结构恶化，导致骨折风险增加。骨形态发生蛋白2（BMP2）作为骨生成的关键诱导因子，具有强大的成骨能力，但其临床应用却面临巨大挑战：半衰期短、易被快速清除，往往需要高剂量给药，而高剂量又会引发免疫反应、异位骨形成等一系列副作用。传统的递送系统，如胶原海绵，存在突释现象，无法实现BMP2的持续释放，限制了其治疗效果。

为了解决这些难题，研究人员将目光投向了离子配对技术。他们设想，能否利用一种临床上已广泛使用的抗骨吸收药物——利塞膦酸盐（Risedronate），作为带负电的配对离子，与带正电的BMP2通过静电作用形成复合物？这种复合物能否像“特洛伊木马”一样，保护BMP2，减缓其释放，并利用利塞膦酸盐本身的抗破骨细胞活性，协同增强成骨效果？此外，如何将这种复合物有效地递送到目标部位，并进一步控制其释放行为？研究团队选择了透明质酸（HA）和温敏型泊洛沙姆407（P407）的混合水凝胶作为载体，旨在构建一个全新的、高效的BMP2局部递送平台。

这项开创性的研究发表在《Archives of Pharmacal Research》上，系统地回答了这些问题。

为开展研究，作者运用了几个关键技术方法：1. 通过离子配对法构建BMP2-利塞膦酸盐离子复合物，并利用动态光散射（DLS）、傅里叶变换红外光谱（FT-IR）和圆二色谱（CD）对其进行物理化学表征和结构完整性分析。2. 采用分子对接和分子动力学（MD）模拟从计算层面预测和验证复合物的相互作用与稳定性。3. 利用C2C12成肌细胞模型，通过碱性磷酸酶（ALP）活性检测、定量PCR（qPCR）、阿尔新红染色和免疫细胞化学等技术，在体外评估复合物的成骨生物活性。4. 将复合物负载于不同浓度的HA及HA-P407混合水凝胶中，进行体外释放研究。5. 使用SD（Sprague-Dawley）大鼠异位骨形成模型，通过微型计算机断层扫描（μCT）和组织学分析，在体内评估其成骨功效。

Characterization of the BMP2-risedronate ionic complex

研究人员成功制备了BMP2-利塞膦酸盐离子复合物。该复合物粒径均匀，约为326±149纳米，多分散指数（PDI）为0.2-0.3，zeta电位为-38.08±0.12毫伏，复合效率高达95%。FT-IR光谱证实了利塞膦酸盐的磷酸酯基团（-POO-）特征峰消失，表明其与BMP2的胺基发生了静电相互作用。CD光谱和SDS-PAGE分析表明，复合物中的BMP2在解离后其二级结构和结构完整性（同源二聚体形式）均得到了良好保持，冻干过程也未对其构象产生显著影响。扫描电镜（SEM）和透射电镜（TEM）显示复合物呈球形，表面光滑，尺寸分布均匀。超分辨率光学显微镜（Cytoviva?）直观地展示了复合物中BMP2（红色）和利塞膦酸盐（绿色）的共存与分布。

Molecular docking of risedronate with BMP2 protein to reveal the potential molecular interactions

分子对接研究表明，利塞膦酸盐与BMP2的结合能约为-5.1 kcal/mol，其主要与BMP2的Asn56、Glu83和Gly110等氨基酸残基发生相互作用。然而，结合口袋并未被完全占据，且相互作用的强度表明其在生理条件下可能发生可逆解离。

Investigation of conformational stability of BMP2-risedronate complex by molecular dynamics(MD) simulation

分子动力学模拟进一步验证了其结合稳定性。在73.1纳秒的模拟中，复合物的结合能波动很大（在20至-500 kJ/mol之间），RMSD值在2至5埃之间波动，表明复合物在生理条件下不能长期保持稳定，利塞膦酸盐与BMP2会发生部分解离。这恰好为BMP2在体内的可控释放提供了理论基础。

In vitro BMP2 release profile from BMP2-risedronate ionic complex

体外释放研究显示，复合物本身的释放行为具有pH依赖性。在模拟体液（SBF, pH 7.4）中，BMP2在3天内几乎完全释放，而在酸性条件（pH 4.8）下，释放较慢。为了控制释放，研究人员将复合物载入水凝胶。研究发现，随着HA浓度（从0.5%增至2%）的增加，BMP2的释放速率显著减慢。引入温敏材料P407形成混合水凝胶（如1% HA + 19% P407）后，释放行为得到进一步调控，其释放曲线符合一级动力学和Hixson-Crowell模型，表明释放由浓度差和基质侵蚀共同控制。

Rheological properties of HA and HA-P407 hybrid hydrogels

流变学研究表明，HA溶液表现出剪切稀化行为，其粘度随温度升高而降低。而HA-P407混合水凝胶则表现出相反的热响应特性：在4°C时粘度最低，在37°C时粘度显著增加，存储模量（G'）始终高于损耗模量（G''），表明其在生理温度下能形成稳定的类凝胶弹性网络。所有配方在4°C和室温下均表现出100%的可注射性。

In vitro cell viability and potency of BMP2-risedronate ionic complex

细胞实验表明，BMP2和BMP2-利塞膦酸盐复合物在100-400纳克/毫升浓度范围内对C2C12细胞无毒性。在几种双膦酸盐药物中，利塞膦酸盐和伊班膦酸盐在0.1-1μM范围内显示出更好的生物相容性。碱性磷酸酶（ALP）活性检测发现，BMP2-利塞膦酸盐复合物处理组的ALP活性显著高于单独BMP2组。qPCR分析显示，复合物处理组中ALP和I型胶原（Collagen Type I）的mRNA表达水平也更高。阿尔新红染色和免疫荧光染色进一步证实，复合物能显著促进C2C12细胞的钙结节形成和I型胶原蛋白表达，证明了其强大的促成骨分化能力。

In vivo osteogenic efficacy of BMP2-risedronate ionic complex

体内异位骨形成实验是最终的 efficacy 检验。将负载有BMP2或BMP2-利塞膦酸盐复合物的HA水凝胶和HA-P407混合水凝胶植入SD大鼠后肢肌肉中。4周后的μCT三维重建图像清晰显示，所有治疗组均形成了异位骨结节，而对照组则没有。定量分析表明，装载复合物的组其骨体积（BV）显著高于单独BMP2组。其中，装载于HA-P407混合水凝胶中的复合物效果最佳，其骨体积比单独BMP2组（在HA中）增加了约2.02倍。骨矿物质密度（BMD）在各组间无显著差异。组织学（H&E染色）分析证实，注射部位形成了包含活性骨细胞和造血骨髓的新生骨小梁，周围被宿主肌肉组织包围，与μCT结果一致。

结论与意义

本研究成功构建了一种新型的BMP2-利塞膦酸盐离子复合物递送系统，并将其与HA-P407混合水凝胶相结合，有效解决了BMP2临床应用中的突发释放和需要高剂量的难题。该复合物不仅能通过静电相互作用实现BMP2的持续、可控释放，还能利用利塞膦酸盐的抗骨吸收特性，协同增强成骨作用，在体外和体内均表现出优于单独BMP2的成骨 efficacy。

该研究的重大意义在于：第一，它创新性地将治疗药物（利塞膦酸盐）本身作为递送载体的一部分，实现了“药物-生长因子”一体化协同治疗，为开发新型复合治疗策略提供了全新思路。第二，该系统通过简单的离子配对方法制备，避免了复杂的化学修饰，较好地保持了BMP2的生物活性。第三，热响应型HA-P407混合水凝胶不仅提供了良好的可注射性和原位凝胶化能力，还能进一步延缓释放，延长BMP2的作用时间，提高局部生物利用度。第四，这种基于离子相互作用的递送平台具有广泛的适用性，有望应用于其他蛋白质类药物或生长因子的递送，在骨再生医学、骨质疏松治疗乃至其他需要局部持续给药的领域展现出巨大的临床应用潜力。