综述：病毒学中分裂蛋白技术的演进：从机制发现与诊断到治疗前景

　　本综述系统梳理了分裂蛋白互补分析（PCA）技术在病毒学研究中的演进历程，从最初作为可视化病毒-宿主蛋白相互作用的机制发现工具（如BiFC、NanoBiT），发展到高通量药物筛选和快速即时诊断（如LUCAS）应用，并前瞻性地探讨了其向可编程治疗性“分裂效应器”（如蛋白酶激活的RELEASE系统、synNotch逻辑门）发展的巨大潜力。文章强调了该技术平台在应对HIV、HBV和SARS-CoV-2等病毒挑战中的核心价值。

　　

分裂蛋白技术：从观测病毒的“眼睛”到精准打击的“智能武器”

引言：对抗病毒的分子军备竞赛

21世纪的人类依然处于与病毒斗争的军备竞赛中。尽管已成功消灭天花，但人类免疫缺陷病毒（HIV）、乙型肝炎病毒（HBV）和严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）等病原体持续构成重大威胁。这些病毒，尤其是那些能建立慢性感染（如HIV潜伏库）或引发突发公共卫生事件（如COVID-19大流行）的病毒，凸显了对新工具和疗法的迫切需求。要实现对病毒的持久控制，必须对其生命周期的各个环节——从进入细胞、基因组复制到病毒颗粒组装和释放——有分子分辨率的深刻理解。这些过程通常由病毒蛋白与宿主蛋白之间复杂且瞬时的相互作用所介导。传统生化技术（如免疫共沉淀）虽功能强大，但通常在细胞裂解液中进行，牺牲了相互作用的空间和时间信息。因此，能够在活细胞中实时观测分子事件的技术变得至关重要，而这正是分裂蛋白技术大放异彩的舞台。

分裂蛋白工具箱：核心原理与重要变体

核心机制：从BiFC到分裂酶

分裂蛋白互补分析（PCA）的核心思想是将一个报告蛋白（如荧光蛋白或荧光素酶）分割成两个本身无活性的片段。将这两个片段分别融合到两个待研究的蛋白上。如果这两个蛋白发生相互作用，就能将报告蛋白片段拉近，使其局部浓度升高，从而驱动片段重新折叠和组装，恢复报告蛋白的活性并产生可检测的光信号。

该理念最初通过分裂绿色荧光蛋白（GFP）在双分子荧光互补（BiFC）实验中得到验证。在典型BiFC实验中，GFP或其更亮、折叠更快的变体Venus的N端和C端片段被分别融合到两个可能相互作用的蛋白上。它们的结合促进了GFP β-桶状结构的不可逆自组装，随后内部发色团成熟，产生荧光信号，永久标记了相互作用的位点。

该原理很快被应用于荧光素酶，其能产生发光的化学反应。分裂的荧光素酶，如海肾（RLuc）和萤火虫（FLuc），与荧光相比，提供了更高的信背比和更宽的动态范围。一个重大突破是NanoLuc的开发，它是一种小（19 kDa）、亮度极高的荧光素酶。其优化的分裂版本NanoBiT包含一个大片段（LgBiT；18 kDa）和一个最小的11个氨基酸肽（SmBiT，现称为HiBiT）。LgBiT和HiBiT之间的亲和力很低；但当它们被融合到相互作用的伴侣上时，会重新组装成一个高亮度的荧光素酶。重要的是，这种相互作用是可逆的，使得实时测量蛋白质结合和解离动力学成为可能，而这对BiFC而言颇具挑战。除了光学报告基因，该原理还被应用于二氢叶酸还原酶（DHFR）等酶，产生的报告基因可赋予抗生素抗性，有助于遗传筛选。

性能指标：为任务选择合适的工具

选择PCA系统需要仔细评估各种性能因素：

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  信背比：衡量特异性信号与片段自发重组产生的噪音的强度比。荧光素酶，尤其是NanoBiT，通常提供最高的信背比，能够检测低水平表达或弱相互作用。

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  动力学与可逆性：选择不可逆还是可逆系统取决于生物学问题。BiFC的不可逆性使其非常适合捕获瞬时相互作用。相反，NanoBiT的快速可逆互补非常适合结合动力学的定量研究以及筛选破坏现有相互作用的抑制剂。

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  成熟时间和氧依赖性：荧光蛋白需要时间和分子氧使其发色团成熟，限制了它们追踪快速事件的能力。相比之下，荧光素酶在底物加入后几乎立即工作。虽然其反应也需要氧，但避免了漫长的成熟延迟，使其在实时动力学研究中更胜一筹。

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  大小与空间位阻：大的报告蛋白片段可能会干扰目标蛋白的功能或定位。微小标签，如1.3 kDa的HiBiT肽，有助于降低这种风险。

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  体内适用性：对于全生物体研究，发光为深部组织成像提供了更高的灵敏度，而荧光则提供了更好的空间分辨率。开发近红外（NIR）报告基因是增强组织穿透性的一个关键目标。

挑战、假象与最佳实践

虽然功能强大，但PCA的应用需要谨慎的实验设计以减少潜在假象并确保数据的稳健性。一个主要问题是假阳性，通常在融合蛋白过表达时出现。高细胞浓度会促进报告蛋白片段的非特异性重组，掩盖真正的生物相互作用。相反，如果融合的报告蛋白片段空间阻碍了天然的相互作用位点或破坏了蛋白质折叠，则会出现假阴性。

对于假阳性，解决方案包括使用诱导型启动子控制表达，或者更理想的是创建具有近内源性表达水平的稳定细胞系。此外，测试N端和C端融合，以及优化肽链连接子的长度和灵活性，通常可以解决问题。由于任何融合标签都可能改变蛋白质功能，关键发现应始终通过正交方法验证，例如天然蛋白质的免疫共沉淀或邻近标记蛋白质组学。

克服过表达假象的一个关键进展是CRISPR/Cas9介导的基因组编辑与人工智能驱动的结构预测之间的协同作用。CRISPR/Cas9允许将分裂蛋白标签精确敲入内源性基因中，而像AlphaFold2这样的工具对于识别不破坏蛋白质天然功能的最佳插入位点至关重要。Xu等人有效证明了这种强大的组合，他们使用AlphaFold2预测来指导CRISPR介导的分裂GFP标签插入内源性微管蛋白，实现了无假象的细胞骨架可视化。

除了这些潜在的实验假象，选择适当的PCA系统还需要考虑其固有的生物物理特性。例如，BiFC的不可逆性有利于捕获弱或瞬时的相互作用，但它排除了对相互作用动力学的研究。相比之下，像NanoBiT这样的可逆系统由于其高信背比和实时响应，已成为定量应用（如测量结合动力学或筛选抑制剂）的金标准。然而，即使是最敏感的系统也有其极限；极其短暂或低亲和力的相互作用（例如，在微摩尔级K_d范围内）可能不足以驱动报告蛋白组装到超过背景噪音。因此，PCA的选择必须与所研究的生物学问题的预期强度和动态仔细匹配。

第一阶段：机制发现——照亮病毒生命周期

掌握了这个基础工具箱并了解其最佳实践后，研究人员首先将分裂蛋白技术应用于解决病毒学中最基本的问题之一：病毒在何时、何地以及如何与宿主相互作用？这标志着这些 assays 演进的第一阶段：它们在机制发现中的实用性。

了解病毒在何处、何时利用宿主机器对于识别治疗靶点至关重要。通过将LgBiT连接到病毒蛋白，将HiBiT连接到宿主蛋白，可以在活细胞内以精确的空间和时间细节绘制相互作用网络。这种方法凸显了不同病毒系统中的关键过程。

对于HIV-1，分裂荧光素酶分析最初绘制了病毒整合酶与宿主因子LEDGF/p75之间的相互作用。高通量筛选后来发现了小分子LEDGINs，它们能阻断这个界面并抑制晚期复制。分裂GFP成像随后揭示了HIV-1 Gag在质膜出芽位点的动态组装。

在HBV研究中，分裂荧光素酶互补揭示了HBV核心蛋白与核运输受体之间可靶向的相互作用。同时，BiFC分析通过HBV X蛋白与线粒体蛋白的相互作用阐明了其抗凋亡机制。

对于SARS-CoV-2，这些分析迅速识别了必需的宿主因子，展示了该平台对新兴病原体的适应性。

第二阶段：应用——从发现到诊断和药物筛选

从第一阶段研究中获得的详细机制见解自然地为下一进化步骤铺平了道路：将这些生物学发现转化为实用工具。第二阶段侧重于将分裂蛋白系统应用于高通量药物筛选和快速诊断，直接利用先前已识别的特定病毒-宿主相互作用。

该平台的多功能性使得抗病毒管线中各种实际应用成为可能，从大规模筛选到即时检测解决方案。

抗病毒药物和宿主因子的筛选

分裂蛋白分析的光学读数非常适合高通量筛选（HTS）活动。表达针对关键病毒-宿主相互作用的分裂报告基因的工程化细胞系能够进行快速化合物筛选，因为这些相互作用的破坏会导致可测量的信号丢失，立即标记出潜在的抑制剂。

在COVID-19大流行期间，Wang等人开发了一种分裂NanoLuc合胞体形成分析（ACE2–LgBiT / Spike-HiBiT），能够快速筛选进入抑制剂和中和血清。同时，Rawson等人开发了一种3CL^pro可切割的分裂NanoLuc生物传感器，有助于鉴定nirmatrelvir类似物。

除了小分子，与PCA耦合的全基因组CRISPR筛选系统地识别了宿主依赖性和限制性因子。对于SARS-CoV-2，这种方法揭示了病毒复制所必需的意外细胞通路，包括先前未表征的膜运输组件。这些平台的适应性扩展到变异监测，分裂蛋白分析经过调整可在30分钟内快速区分针对不同病毒株的中和抗体反应，展示了它们在药物发现和诊断应用方面的潜力。

工程化病毒蛋白酶传感器作为复制窗口

许多病毒依赖病毒蛋白酶来切割多蛋白前体。由蛋白酶识别序列桥接的分裂报告基因可产生直接的、实时的复制读数，并促进蛋白酶抑制剂的高通量筛选。

即时诊断（POCT）

分裂荧光素酶平台支撑了快速测试，例如LUCAS，它能在不到一小时内以ELISA般的灵敏度检测抗SARS-CoV-2抗体。其适应性表明可用于多种病原体的类似检测方法。

加速进化：系统化工程与人工智能引导设计

虽然第二阶段描述的应用功能强大，但它们的开发通常受到一个显著瓶颈的限制：为每个新靶点设计新的分裂蛋白传感器的缓慢、手动过程。克服这一局限性的需求刺激了更系统化方法的发展。这些高通量发现平台通过将传感器设计从一门艺术转变为数据驱动的科学，极大地加速了整个领域的演进。

“分裂位点”问题与手动时代

开发新PCA的一个关键挑战是找到最佳的“分裂位点”，即蛋白质可以在不丧失其重折叠能力的情况下被切割的位置。多年来，这是一个缓慢的试错过程，基于结构直觉的手动测试数十个单独构建体。这种手工方法显著减缓了新传感器的开发。

系统化发现分裂位点

高通量发现平台的开发通过将其从手动、试错过程转变为系统化、数据驱动的工作流程，加速了生物传感器的设计。一个代表性的例子是高通量分裂蛋白分析（HiTS）平台，其核心涉及三个关键步骤：

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   文库生成：首先，使用DNA转座子随机片段化报告蛋白（如抗生素抗性酶（ARG））的基因，创建一个庞大的潜在分裂位点文库。

2. 2.

   功能选择：这是识别功能变体的关键步骤。报告蛋白片段文库被融合到一对可诱导的相互作用伴侣（如FRB和FKBP）上，其相互作用由小分子（如雷帕霉素）严格控制。在细胞中表达该文库后，施加选择压力。在诱导物存在下，相互作用迫使抗生素抗性酶片段互补。只有包含“允许”分裂位点（即允许片段重新组装成功能性酶）的细胞才会获得表型活性并在含有相应抗生素的培养基中存活。没有诱导物时，无相互作用发生，细胞对抗生素敏感。这种条件性存活允许对最佳分裂位点进行高度严格的选择。

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   深度测序：最后，收集富集的存活细胞群体，并通过下一代测序分析它们的质粒。将测序读数映射回报告基因，生成一个全面的“分裂位点图谱”，揭示所有允许的断裂点。这个过程极大地简化了最佳分裂位点的发现，为快速定制新的生物传感器提供了丰富的数据集。

与人工智能和机器学习的协同作用

此类高通量方法的影响不仅仅在于加速发现；它们产生的大量数据集非常适合训练机器学习模型。通过分析数千个允许和非允许的分裂位点，可以开发人工智能引导的工具来预测任何蛋白质的最佳分裂点， potentially 完全绕过实验筛选。高通量实验与计算预测之间的这种协同作用代表了下一波创新浪潮，有望使定制生物传感器的设计几乎瞬间完成，并推动整个领域走向完全自动化的设计-构建-测试-学习（DBTL）循环。

治疗前沿：设计分裂效应器迈向可编程疗法

随着快速设计和优化生物传感器能力的出现，科学界开始提出一个更雄心勃勃的问题：我们能否重新利用这项技术，不仅是为了观察病毒，而是为了消灭它？这一追问标志着这一演进旅程中最激动人心和最具挑战性的阶段的开始——向治疗前沿推进，并为选择性抗病毒作用和未来治疗应用设计可编程效应器。

核心逻辑：从报告基因到可编程效应器

从分裂报告基因到治疗效应器的概念飞跃涉及将该系统重新设计为模块化的细胞内传感器-执行器装置。该系统不是重新组装一个被动的报告基因，而是在受感染的细胞内独家重建或激活一个强效的、能杀死细胞或具有治疗功能的蛋白质——“效应器”。该策略的关键在于利用病毒独特的分子特征作为触发器。病毒蛋白酶是病毒生命周期所必需的，由于其高度特异性，是激活此类系统的理想触发器。例如，SARS-CoV-2的木瓜样蛋白酶（PL^pro）是一个经过充分验证的抗病毒靶点，使其成为激活此类系统的完美候选者。这创建了一个高度特异性的“与门”逻辑：只有当（A）细胞被感染（病毒蛋白酶存在）AND（B）治疗构建体存在时，治疗作用才会被释放。

构建效应器：蛋白酶控制的激活与递送

蛋白酶激活疗法的原理已通过通用平台如RELEASE（内质网保留可切割分泌系统）得到优雅证明。在该系统中，一种治疗性蛋白质被设计成被困在内质网中。只有在特定蛋白酶（如来自病毒的蛋白酶）存在时，该蛋白质才会被切割并释放以执行其功能，例如诱导凋亡或向免疫系统发出信号。这种模块化设计有效地将蛋白酶信号转换为可编程的治疗输出。

至关重要的是，这一概念已在体内得到验证。研究人员开发了一种“前载体”（provector），一种由疾病相关蛋白酶激活的腺相关病毒（AAV）载体。在心肌梗死模型中，该前载体证明了能向具有高蛋白酶活性的受损组织进行位点特异性基因递送，同时显著减少了在肝脏等健康器官中的脱靶效应。这项研究提供了强有力的概念验证，表明蛋白酶激活系统可以在复杂的活体 organism 中实现高靶标特异性，这是向病毒性疾病临床转化迈出的关键一步。

先进设计：多输入逻辑与安全开关

虽然单一触发器功能强大，但治疗设计的未来在于更复杂的逻辑以增强安全性和精确性。一种替代或补充的方法是使用工程化受体（如合成Notch（synNotch））感知受感染细胞表面的病毒蛋白。这使得可以创建可编程的免疫细胞，能够识别受感染细胞，然后，例如，激活局部治疗反应。

任何治疗效应器的首要关注点是安全性。必须严格解决即使是最小程度的“泄露”激活或逃逸突变体出现所带来的脱靶毒性风险。这方面的灵感来自先进的生物防护系统。像“Deadman”和“Passcode”这样的杀死开关设计利用复杂的转录电路来确保在缺乏特定存活信号时细胞死亡。此外，“恶魔与天使”构建体通过使单个必需基因同时负责细胞活力和条件性杀死，提供了遗传稳定的杀死开关，从而降低了功能丧失突变的发生概率。

这种多层安全方法的潜力在一个包含三重杀死开关的工程化结核分枝杆菌菌株中得到了惊人展示。在撤除稳定药物后，该菌株在动物模型中被迅速清除，逃逸突变率几乎检测不到。此外，持续的工程努力，例如开发具有显著降低的配体非依赖性激活的增强型synNotch受体，展示了构建更安全、更精确治疗模块的清晰轨迹。这些例子为构建具有多重、冗余安全机制的下一代抗病毒效应器提供了清晰的路线图，支持了通向更安全、更精确的可编程疗法的路线图。

生物安全、伦理和监管考虑

将分裂蛋白系统从观察性报告基因转化为干预性分裂效应器需要结构化的风险管理。虽然仅使用非感染性构建体的报告基因工作通常在BSL-2条件下由机构生物安全委员会（IBC）监督进行，但涉及传染性病原体的研究需要根据病原体进行相应级别的防护。由于效应器是可编程的，它们受到两用研究关切（DURC）政策的约束，需要采取序列筛选和内部风险审查等措施。设计必须使用多输入逻辑（例如与门）、正交识别对和条件性降解来最小化泄露和脱靶激活，并应通过定量报告基础 versus 诱导活性、动态范围、动力学和可逆性进行验证。

一个最小的临床前矩阵应包括体外特异性面板和体内剂量反应、生物分布/持久性（如果使用载体化，还包括脱落）以及毒理学研究，并遵循3Rs/ARRIVE指南。监管路径因应用而异：诊断需要在IVD框架（例如CLSI EP05/EP17）内进行分析和临床验证，而治疗性分裂效应器则遵循基因治疗指南，包括 pre-IND 咨询、GLP临床前研究和GMP/CMC package（定义特性、纯度、稳定性和效力）——支持向可编程疗法负责任的、分阶段的推进。

当前局限性与转化路径

区分分裂蛋白应用的成熟度至关重要：虽然报告基因是成熟的研究工具，但干预性分裂效应器仍处于临床前概念验证阶段。它们通往临床的道路受到重大障碍的限制，包括有效的体内递送、在消除脱靶激活的同时确保绝对特异性、潜在的免疫原性以及可扩展制造和质量控制的挑战。

前进的道路需要分阶段、证据驱动的方法。它始于对构建体安全性和有效性的严格体外验证，然后是全面的临床前体内研究以评估药理学和毒理学。成功的候选者随后进入IND enabling package，得到GLP研究和完整的CMC计划的支持，以获得监管批准进行早期临床试验。这一进展与6.4节详述的生物安全和监管框架内在关联。

结论

分裂蛋白技术已从分子奇观演变为现代病毒学中至关重要且充满活力的平台。通过将复杂的分子事件转化为清晰的光学信号，它们持续加速了抗病毒管线各个阶段的发现——从基础机制发现到高通量药物筛选和快速诊断。这一演进现在正进入其最具变革性的阶段，由数据驱动的系统化工程、人工智能引导的设计以及合成生物学的强大工具包汇聚所推动。

展望未来，最激动人心的前沿在于将这些系统转化为可编程疗法。虽然这仍然是一个长期的愿景，但概念和技术蓝图正在积极绘制中。通过将分裂蛋白传感器与多输入逻辑门集成，通过经过体内验证的智能递送载体部署它们，并用基因编码的多层安全开关加固它们，一类新的抗病毒剂将会出现。虽然临床转化确实存在巨大的障碍，但这些智能治疗系统有潜力实现选择性靶向受感染细胞，推动该领域向可编程疗法迈进；临床转化将需要在相关模型中获得大量额外证据。