动态超声造影灌注分析术前预测肝细胞癌侵袭性亚型（MTM与高Ki-67型）的价值研究

　　本研究针对肝细胞癌（HCC）中侵袭性较强的巨梁-团块型（MTM）亚型和高Ki-67表达模式术前识别困难的问题，通过结合临床数据、超声造影（CEUS）特征及动态定量参数，构建了Clinic-Q-CEUS预测模型。该模型在预测MTM亚型和高Ki-67表达方面表现出优异性能（AUC分别达0.860和0.836），显著优于仅基于临床和影像特征的模型，为HCC患者术前精准分型、个体化治疗决策及预后改善提供了重要影像学依据。

　　

肝细胞癌（HCC）是全球第六大常见癌症和第三大癌症死亡原因，其中超过80%的病例为HCC。患者总体预后较差，且不同亚型的预后存在显著差异。近年来，多种与临床结局相关的侵袭性HCC亚型被识别，其中巨梁-团块型（Macrotrabecular-massive, MTM）亚型和高Ki-67表达模式备受关注。MTM-HCC被定义为存在超过50%的巨梁结构（厚度超过6个细胞），而Ki-67作为细胞增殖的生物标志物，反映肿瘤的增殖活性。这两种亚型均与术后复发和不良临床结局密切相关。然而，它们的确认目前完全依赖于侵入性组织病理学检查。术前无创识别这些侵袭性亚型，对于制定个性化治疗计划、改善患者预后具有重要意义。

以往的研究表明，增强计算机断层扫描（CT）和增强磁共振成像（MRI）的某些影像学特征与侵袭性HCC亚型相关。对比增强超声（CEUS）已广泛应用于HCC的诊断、监测和随访，它利用血管灌注信息分析病变性质，提供实时、无创的HCC可视化。然而，仅有有限的研究表明CEUS特征可用于识别疑似侵袭性HCC亚型的患者。此外，CEUS检查严重依赖操作者经验，使得结果解读易受主观干扰。因此，借助定量工具对CEUS视频进行客观评估，可能有助于提高对侵袭性HCC亚型的诊断准确性。

动态CEUS通过时间-强度曲线（TIC）实现肿瘤灌注的定量评估，从而更客观地分析微小的增强差异，最大限度地减少操作者主观性的影响。使用Vuebox?软件对乳腺、胰腺、甲状腺和肝脏肿瘤的动态CEUS进行定量分析已有报道，但其用于识别MTM-HCC和Ki-67表达模式尚未见报道。本研究旨在评估使用Vuebox?软件进行动态CEUS定量分析在术前区分HCC患者MTM亚型和高Ki-67表达模式的潜力，并开发基于临床数据、CEUS特征及相关定量参数的预测模型，以识别MTM-HCC和高Ki-67表达模式。

本研究得到了复旦大学附属中山医院伦理委员会的批准（编号：B2022-569R）。回顾性队列的患者知情同意要求被豁免，前瞻性验证研究的所有参与者均签署了书面知情同意书。研究包括一个回顾性单中心初级队列（用于识别独立特征和预测模型开发）和一个前瞻性双中心验证队列（用于预测模型测试）。初级队列纳入了2023年1月至2023年12月在复旦大学附属中山医院（机构1）接受术前CEUS并经病理证实的连续HCC患者。纳入标准包括：（1）术前1个月内使用Sonovue?（Bracco）进行肝脏CEUS；（2）通过术后病理检查确诊为HCC；（3）未接受任何术前治疗。排除标准为：（1）CEUS视频质量差或DICOM记录少于120秒；（2）缺乏所需的临床或病理信息。验证队列由2024年1月至2024年4月期间在复旦大学附属中山医院（厦门）（机构2）和机构1满足上述标准的HCC患者组成。

所有HCC患者术后均进行了组织病理学评估。记录的病理特征包括：肿瘤大小、病灶数量、Edmonson-Steiner分级、肝硬化、卫星结节、大血管侵犯、微血管侵犯（MVI）和包膜侵犯。两位不了解CEUS信息的腹部病理学家审查了所有手术切片。当存在多个肿瘤时，分析最大直径的肿瘤。MTM亚型通过苏木精-伊红（H-E）染色切片根据2019年世界卫生组织（WHO）标准进行诊断。肿瘤切片用Ki-67抗体染色，高Ki-67模式定义为>20%的免疫阳性。

为确保影像解读的可靠性，超声（US）和CEUS图像由两位不了解患者信息的放射科医生（分别拥有超过5年经验）独立审阅。出现不一致时，咨询一位拥有20年腹部CEUS经验的资深放射科医生。如果患者有多个肿瘤病灶，则评估最大的肿瘤病灶。资深放射科医生在4周后重新评估所有病例以最小化回忆偏倚。评估的B模式US和CEUS特征包括：（1）平均肿瘤大小；（2）右叶受累；（3）回声强度；（4）不均匀回声；（5）形状不规则；（6）边界不清；（7）血流信号；（8）晕征；（9）瘤内坏死；（10）瘤内动脉；（11）瘤周滋养血管；（12）动脉期（AP）增强模式；（13）AP增强包膜；（14）AP分支样增强；（15）门静脉期（PVP）增强程度；（16）延迟期（LP）增强程度。所有患者均应用美国放射学院CEUS肝脏影像报告和数据系统（LI-RADS）（2017版）进行分类。

CEUS的DICOM视频使用VueBox?软件（Bracco）由一位不了解临床病理和CEUS信息、拥有5年经验的独立放射科医生进行离线分析。分析前，使用与超声系统匹配的特定校准文件对DICOM视频进行校准。系统观察整个造影过程，并手动勾画四个感兴趣区（ROI）。边界ROI（青色）为包含病灶区域和部分正常肝组织的方形区域。病灶ROI（绿色）根据肿瘤特征在边界ROI内绘制。参考ROI（黄色）在肿瘤附近的正常肝组织内勾画，预设面积大小（约1 cm2）。病灶周围3mm外的肝实质定义为边缘ROI（洋红色）。除边界ROI外，其他ROI的深度尽可能保持相似，同时确保TIC曲线拟合质量大于75%，并注意避开周围大血管。采用运动补偿以最小化呼吸运动伪影。内置算法自动生成TIC及各种定量参数，包括平均对比信号强度（MeanLin）、峰值增强（PE）、流入曲线下面积（WiAUC）、上升时间（RT）、局部平均通过时间（mTTl）、达峰时间（TTP）、流入速率（WiR）、流入灌注指数（WiPI）、流出曲线下面积（WoAUC）、流入和流出曲线下面积（WiWoAUC）、下降时间（FT）和流出速率（WoR）。TIC曲线拟合质量大于75%被视为分析成功。

连续变量以均数和标准差（SD）表示，分类变量以数量和百分比表示。采用非配对Student t检验或Mann-Whitney检验分析连续变量组间差异，采用Fisher精确检验或卡方检验分析分类变量组间差异。采用单变量和多变量逻辑回归分析识别侵袭性HCC亚型的独立预测因子，并将其组合用于预测模型构建。定量参数的截断值使用Youden指数计算，诊断性能通过受试者工作特征曲线（ROC）分析评估。US和CEUS特征的观察者间和观察者内一致性采用Cohen's kappa统计量评估。采用DeLong's检验比较两个模型的AUC（95% CI）。采用McNemar检验比较两个模型的敏感性、特异性和准确性。所有统计分析均使用SPSS软件（版本27.0, IBM）进行。双侧p值<0.05表示差异具有统计学意义。

2023年1月至2023年12月期间，共有118名患者（平均年龄61岁±10[SD]；88名男性）纳入初级队列，52名患者（平均年龄62岁±11[SD]；42名男性）纳入验证队列。临床和病理特征比较显示，初级队列中甲胎蛋白异质体（AFP-L3%）>10 U/mL的患者较少（118人中有41人[34.7%] vs. 52人中有30人[57.7%]，p=0.005），而其他特征在两个队列间无显著差异。在初级队列中，118例HCC中分别有37例（31.3%）和53例（44.9%）为MTM亚型和高Ki-67表达模式。MTM-HCC中高Ki-67表达模式的比例显著高于非MTM-HCC（37例中有26例[70.3%] vs. 81例中有27例[33.3%]，p<0.001）。与非MTM-HCC患者相比，MTM-HCC患者更易出现术前血清甲胎蛋白（AFP）>20 ng/mL（37例中有23例[62.2%] vs. 81例中有22例[27.2%]，p<0.001）、AFP-L3%>10 U/mL（37例中有20例[54.0%] vs. 81例中有21例[25.9%]，p=0.013）、更大的主肿瘤大小（平均6.1 cm±3.2[SD] vs. 4.6 cm±2.2[SD]，p=0.015）、Edmonson-Steiner III或IV级肿瘤（37例中有25例[67.5%] vs. 81例中有5例[6.1%]，p<0.001）、大血管侵犯（37例中有3例[8.1%] vs. 81例中有0例[0%]，p=0.029）和微血管侵犯（MVI）（37例中有22例[59.5%] vs. 81例中有14例[17.2%]，p<0.001）。并行分析显示，与低Ki-67表达模式的HCC患者相比，高Ki-67表达模式的HCC患者似乎更年轻（平均59岁±9[SD] vs. 63岁±11[SD]，p=0.030），且更多出现术前血清AFP>20 ng/mL（53例中有26例[49.1%] vs. 65例中有19例[29.2%]，p=0.027）、AFP-L3%>10 U/mL（53例中有27例[50.9%] vs. 65例中有14例[21.5%]，p≤0.001）、更大的主肿瘤大小（平均5.7 cm±3.2[SD] vs. 4.6 cm±2.0[SD]，p=0.028）、Edmonson-Steiner III或IV级肿瘤（53例中有25例[47.1%] vs. 65例中有5例[7.6%]，p<0.001）和微血管侵犯（53例中有23例[43.3%] vs. 65例中有13例[20.0%]，p=0.006）。

B模式US和CEUS特征分析显示，与非MTM-HCC相比，MTM-HCC更常出现大于5 cm（37例中有19例[51.4%] vs. 81例中有27例[33.3%]，p=0.047）、瘤内坏死（37例中有21例[56.8%] vs. 81例中有26例[32.1%]，p=0.011）、瘤内动脉（37例中有14例[37.8%] vs. 81例中有14例[17.3%]，p=0.015）、瘤周滋养血管（37例中有23例[62.2%] vs. 81例中有32例[39.5%]，p=0.022）、AP不均匀增强（37例中有33例[89.2%] vs. 81例中有55例[67.9%]，p=0.013）、AP分支样增强模式（37例中有10例[27.0%] vs. 81例中有7例[11.1%]，p=0.029）和PVP低/明显低增强（37例中有27例[73.0%] vs. 81例中有41例[50.6%]，p=0.023）。与低Ki-67表达模式的HCC相比，高Ki-67表达模式的HCC更常出现瘤内坏死（53例中有27例[50.9%] vs. 65例中有20例[30.8%]，p=0.026）和AP分支样增强模式（53例中有14例[26.4%] vs. 65例中有5例[7.7%]，p=0.006）。B模式US和CEUS特征的观察者间一致性为中等至优秀（k=0.658-0.931），观察者内一致性分析为优秀（k=0.853-0.983）。MTM-HCC与非MTM-HCC（p=0.128）或高Ki-67与低Ki-67表达模式的HCC（p=0.281）在CEUS LI-RADS 2017版分类上没有明显差异。

动态CEUS定量分析显示，与非MTM-HCC的动态CEUS定量参数相比，MTM-HCC显示出更高的肿瘤MeanLin比值、边缘MeanLin比值、边缘PE比值、边缘WiAUC比值、边缘WiPI比值、边缘WoAUC比值和边缘WiWoAUC比值（所有p<0.001）。与低Ki-67表达模式的HCC相比，高Ki-67表达的HCC显示出更高的肿瘤MeanLin比值、肿瘤PE比值、肿瘤WiPI比值、边缘MeanLin比值、边缘PE比值、边缘WiAUC比值、边缘WiR比值、边缘WiPI比值、边缘WoR比值（所有p<0.001）。基于初级队列的ROC分析，预测MTM-HCC的最佳截断值估计为肿瘤MeanLin比值≥3.96、边缘MeanLin比值≥1.43、边缘PE比值≥1.55、边缘WiAUC比值≥1.41、边缘WiPI比值≥1.50、边缘WoAUC比值≥1.32和边缘WiWoAUC比值≥1.32。而对于高Ki-67模式的识别，最佳截断值估计为肿瘤MeanLin比值≥2.98、肿瘤PE比值≥3.52、肿瘤WiPI比值≥6.52、边缘MeanLin比值≥1.75、边缘PE比值≥2.21、边缘WiAUC比值≥1.54、边缘WiR比值≥2.05、边缘WiPI比值≥2.55和边缘WoR比值≥2.29。

通过结合临床数据和US/CEUS特征的多变量逻辑回归方程，构建了用于预测MTM亚型（变量：AFP水平、瘤内坏死、瘤周滋养血管）和高Ki-67模式（变量：年龄、AFP-L3%水平、AP分支样增强）的Clinic-CEUS模型。来自初级队列的Clinic-CEUS模型的截断值对于MTM亚型和高Ki-67模式分别为0.25和0.32。进一步的多变量逻辑回归分析显示，血清AFP>20 ng/mL（比值比[OR]=4.2；95% CI：1.5-11.7；p=0.007）、PVP低/明显低增强（OR=3.6；95% CI：1.2-10.5；p=0.019）、肿瘤MeanLin比值≥3.96（OR=7.1；95% CI：2.4-20.7；p<0.001）和边缘MeanLin比值≥1.43（OR=4.4；95% CI：1.3-14.9；p=0.018）与MTM亚型独立相关。而年龄小于59岁（OR=3.1；95% CI：1.2-7.8；p=0.016）、血清AFP-L3%>10 U/mL（OR=3.1；95% CI：1.2-8.0；p=0.022）、肿瘤MeanLin比值≥2.98（OR=2.9；95% CI：1.0-8.2；p=0.049）和边缘WiPI比值≥2.55（OR=4.8；95% CI：1.6-13.8；p=0.004）与高Ki-67模式独立相关。通过结合这些预测因子与逻辑回归方程，构建了用于预测MTM亚型（变量：AFP水平、PVP增强程度、肿瘤MeanLin比值和边缘MeanLin比值）和高Ki-67模式（变量：年龄、AFP-L3%水平、肿瘤MeanLin比值和边缘WiPI比值）的Clinic-Q-CEUS模型。来自初级队列的Clinic-Q-CEUS模型的截断值对于MTM亚型和高Ki-67模式分别为0.22和0.39，随后应用于验证队列进行性能评估。

诊断性能评估显示，上述逻辑回归模型的诊断性能如表5和图6所示。Clinic-Q-CEUS模型在预测MTM亚型和高Ki-67模式方面的区分能力均优于Clinic-CEUS模型，无论是在初级队列（AUC：0.860 vs. 0.753，p=0.027 和 0.836 vs. 0.738，p=0.036）还是验证队列（AUC：0.868 vs. 0.693，p=0.046 和 0.787 vs. 0.610，p=0.018）中。

研究的结论和讨论部分强调，HCC中的MTM亚型和高Ki-67模式是两种与不良预后相关的侵袭性类型。MTM亚型在2019年WHO第五版分类中首次被确认，其特征是显著的厚梁结构（6-10个细胞厚度）和频繁的血管侵犯。MTM-HCC通常表现为较大的肿瘤尺寸、瘤周卫星结节、大/微血管侵犯和胆道侵犯。高达60-70%的MTM-HCC在组织学或影像学上表现出自发性瘤内出血和坏死，这可能与血管生成失调和血供不足有关。特别是，MTM-HCC的Ki-67增殖指数（约35-40%）显著高于非MTM-HCC（约15-20%），反映了其高增殖生物学特性。这些特征使得MTM-HCC易早期复发且预后不良。如果能在术前准确诊断MTM-HCC，就能提供最佳的临床诊断和治疗方案，因为肝移植或射频消融不适用于此类患者，而经动脉化疗栓塞（TACE）联合抗血管生成疗法或基于免疫检查点抑制剂的免疫疗法与更长的无病生存期相关。外科医生应进行解剖性肝切除术或更宽切缘的切除术，并建议缩短随访间隔进行监测。因此，术前无创识别这两种侵袭性亚型可能有助于个体化治疗并改善患者预后。

本研究首次报道了基于Sonovue?的CEUS定量参数在术前识别MTM亚型和高Ki-67模式中的应用价值。结果表明，肿瘤MeanLin比值和边缘MeanLin比值，以及肿瘤MeanLin比值和边缘WiPI比值，分别是MTM亚型和高Ki-67模式的独立预测因子。HCC表现的AP高增强是由于新生血管形成，导致动脉血流量净增加以及未成熟血管通透性增加。血管生成激活是MTM-HCC的主要致癌途径，血管生成素-2（Ang-2）和血管内皮生长因子（VEGF）过表达协同促进血管生成。MTM-HCC中肿瘤和边缘较高的MeanLin比值可能通过丰富的瘤内动脉和瘤周滋养血管来解释。同时，本研究发现高Ki-67模式在初级队列的MTM亚型中比非MTM亚型更常见。Ki-67水平代表活跃的肿瘤细胞增殖程度，高Ki-67模式与肿瘤侵袭性和转移密切相关。肿瘤侵袭通常始于肿瘤边缘，表现为新生血管生成增加。管腔更大、通透性更好的新血管允许更多造影剂进入肿瘤边缘组织，从而增加单位时间的灌注量。值得注意的是，与时间相关的定量参数（如RT、mTTl、TTP和FT）在组间比较中均无统计学差异。这可能受到造影剂注射速度和个体差异等因素的影响。

本研究开发的Clinic-Q-CEUS模型在识别MTM亚型或高Ki-67模式方面均显著优于Clinic-CEUS模型。Clinic-CEUS模型模拟了放射科医生在典型临床情况下基于患者临床信息和CEUS特征的决策过程，而Clinic-Q-CEUS模型通过进一步整合客观的CEUS定量参数，弥补了不同经验放射科医生主观解读的偏差。本研究证明了CEUS定量参数在预测侵袭性HCC亚型方面的价值，这是向将常规定量分析应用于临床实践迈出的一步，并可能为选择可能对现有靶向疗法有反应的患者提供指导。

本研究存在几个局限性。首先，研究结果基于手术切除的肿瘤，不能代表全部HCC谱系，存在固有的选择偏倚。目前结果仅适用于手术队列，未来需要在晚期疾病患者或接受活检的患者中进一步验证。其次，由于初级队列是回顾性研究，并且许多病例因DICOM视频质量差而被排除，诊断准确性可能被高估。第三，由于初级队列回顾性收集了过去两年的数据且缺乏随访时间，动态CEUS定量参数与侵袭性HCC亚型总体预后之间的关联值得未来进一步探索。第四，当前研究未包括使用Sonozoid?的CEUS病例（因技术限制），未来需要专门的定量软件来分析其独特的药代动力学行为，并明确库普弗（Kupffer）期是否能提供额外的预测信息。最后，总体队列样本量较小，模型的效能需要在大型多中心前瞻性研究队列中进行验证。

总之，动态CEUS的定量参数可以作为临床数据和CEUS特征的有用补充，用于术前识别HCC患者的MTM亚型和高Ki-67模式。肿瘤MeanLin比值和边缘MeanLin比值，以及肿瘤MeanLin比值和边缘WiPI比值，分别是MTM亚型和高Ki-67模式的有价值预测因子。